CDD：circATG7促进细胞自噬和胰腺癌的形成与生长 | 转录调控专题

论文标题：Autophagy-associated circRNA circATG7 facilitates autophagy and promotes pancreatic cancer progression

刊登日期：2022年03月

发表杂志：Cell Death & Disease

影响因子：9.685

研究机构：深圳大学总医院深圳市重点实验室肝胆外科，深圳大学医学部生物医学工程学院，深圳大学广东省免疫与疾病重点实验室

文章架构

主要研究内容

01circATG7被鉴定为PC中候选自噬相关circRNA

图1

该研究首先对6个PC和癌旁组织进行去rRNA建库测序，构建circRNA表达谱。随后作者根据自己开发出的PRISMA流程（去重→去除在PubMed上已报道的→去除表达量低的→去除与自噬无关的）筛选出自噬相关的候选circRNA——circATG7。通过表达谱和Qpcr分析表明，与癌旁组织相比，circATG7在PC组织中的表达量更高（图1A, 1B）。KM生存分析发现circATG7的高表达与较低的总生存率相关（图1C）。ROC曲线表明circATG7的可区分值可用于评估PC和癌旁组织（图1D）。ISH结果表明，与癌旁组织相比，PC组织中circATG7表达量更高（图1E, 1F）。qPCR分析表明，与正常胰腺上皮细胞相比，circATG7在PC细胞PANC-1和MIA PaCa-2中表达最高（图1G）。

LC3作为PC组织的生物标志物，作者通过共聚焦显微镜观察了32个样本中被特定荧光染色的LC3点，按照点数多少进行排序，取中位数分两组，LC3多的一组中circATG7表达量更高，并与LC3点数呈正相关（图1H-1K）。EBSS和缺氧处理后，PC细胞中的circATG7表达显著增加（图1L, 1M）。上述结果表明circATG7可能是自噬相关的候选circRNA。

02circATG7的来源及亚细胞定位

  图2

从circBase数据库查到circATG7位于3号chr上，长2119 bp，由宿主基因ATG7的外显子1-2环化产生，该结果经过sanger测序进一步验证（图2A）。作者通过qPCR测定发现ATG7在细胞核和细胞质中表达量相近（图2D）。在FISH实验中，通过荧光显微镜观察到circTAG7在细胞核和细胞质中均有表达（图2E, 2F）。以上结果表明circATG7位于PC细胞的细胞核和细胞质中。

03 circATG7促进PC细胞在体外的增殖和侵袭

图3

为了研究circATG7在PC细胞增殖和侵袭中的作用，作者通过构建circATG7敲低和过表达稳转株进行了功能丧失和过表达实验。通过CCK-8测定、EDU荧光检测、Transwell法测定以及免疫荧光染色结果表明，circATG7过表达可促进PC细胞增殖、侵袭和EMT的能力，circATG7敲低后结果相反。

04ATG7的敲低逆转了circATG7对PC细胞增殖、侵袭和自噬的促进作用

图4

circRNA通过亲本依赖机制调节生物学功能。通过构建ATG7敲低瞬转株，促使细胞内circATG7表达降低，通过CCK-8测定、菌落集成测定和EDU荧光检测发现ATG7基因的敲低抑制了circATG7过表达对PC细胞增殖和侵袭的促进作用（图4A-4D）。通过共聚焦显微镜观察和透射电镜，发现circATG7表达下调也使PC细胞中自噬体数量下降（图4E-4G）。

05 胞质circATG7通过miR-766-5p增强ATG7的mRNA水平

图5

细胞质ncRNA通常通过ceRNA机制调节生物学功能，因此作者推测circATG7是否通过调节miRNA来调节ATG7的表达。在circBase中预测出18个由circATG7调节的miRNA，在TargetScan中预测出928个调节ATG7的miRNA，交叉分析后确定了7种miRNA（图5A）。其中miR-766-5p在PC细胞的circATG7探针上含量最高（图5B）。此外还发现miR-766-5p携带circATG7和ATG7的结合位点（图5E）。通过qPCR测定分析，发现circATG7，miR-766-5p和ATG7表达显示出很高的相关性（图5F-5H）。这些结果表明，细胞质circATG7通过结合miR-766-5p增强ATG7的mRNA水平。

06核circATG7通过富集HUR增强ATG7 mRNA的稳定性

图6

通过RNA pulldown测定，发现多种蛋白可以与circATG7结合，其中HUR蛋白结合度最高。蛋白质印迹和RIP结果显示circATG7显著富集HUR蛋白（图6A-6D）。共聚焦实验观察到circATG7和HUR共同定位于细胞核中（图6E）。作者基于TCGA数据，发现HUR蛋白在PC组织中表达量更高，并且与PC组织中ATG7的表达呈正相关（图6F, 6G）。发现敲低HUR能够抑制circATG7对ATG7表达的促进作用。此外敲低HUR能够提高过表达circATG7的细胞中mRNA降解速率（图6H-6J）。这表明细胞核中的circATG7可以通过富集HUR来增强ATG7的mRNA稳定性。

07circATG7通过miR-766-5p和ATG7促进体外PC细胞增殖、侵袭和自噬

图7

通过CCK-8检测、菌落形成测定、transwell测定以及使用共聚焦显微镜和透射电镜，发现过表达miR-766-5p、敲低HUR蛋白或者添加自噬抑制剂3-MA均显著抑制了circATG7对PC细胞增殖、侵袭和自噬的促进作用。

08动物实验

图8

最后，作者构建了异种移植肿瘤模型，发现过表达circTAG7可促进PC组织生长，敲低circTAG7后，表现为PC组织的生长受到明显抑制。IHC显示过表达circATG7可显著增加PC生物标志物KI67、PCNA和LC3的表达，并增加了肺组织中的转移病灶数量。敲低circATG7后，KI67、PCNA、LC3表达降低，肺组织中的转移病灶数量也明显减少。体内实验结果表明，circATG7可促进PC细胞在体内的增殖、转移和自噬。

总结

该研究表明，自噬相关的circATG7通过miR-766-5p / ATG7和HUR / ATG7轴促进增殖、侵袭和自噬，靶向circATG7可能是PC患者的潜在治疗策略。

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