聚焦时空分子医学的空间转录组技术 | 空间转录组专题

空间转录组技术旨在对细胞的基因表达进行定量测量，同时提供细胞在组织空间的具体位置信息。与传统的转录组技术相比，空间转录组技术能获得细胞在组织生理环境下真实的基因表达特征，以及与微环境的关系，进一步推进对正常和病理状态下细胞特性的理解。

随着生物技术的快速发展，科学家们将临床表型的空间化、时间化与多组学信息的结合，创造了时空分子医学的概念，从四维角度加深对患者的的理解，从而有助于患者的诊断和治疗。

时空分子医学是一门新兴的医学学科，可以精确地了解发病机理，病史和流行病学，旨在与时空相关的多维层面上实现对人类疾病分子水平的预防、诊断和治疗。时空分子医学最重要的部分是将个体的临床现象与分子改变精确联系起来，并在分子改变的基础上理解临床现象的改变。时空分子影像的概念是通过空间测量和跨组学将分子谱的动态和定位与临床影像组学和病理形态学进行整合。在时空测量和分析中，空间转录组学利用人工智能、计算机编程和可视化技术，在组织学切片和分子谱之间架起桥梁并提供相应信息，如细胞-细胞相互作用、转录因子分布以及细胞的空间位置和mRNA表达等。

空间转录组技术

TECHNOLOGICAL

转录组技术的发展主要经历了三个重要的阶段：第一个阶段是对大量混合细胞进行转录组测序，该方法获得的是大量细胞的基因平均表达水平，虽然推进了对细胞群体的特性认识，但无法获知群体内特定细胞的基因表达情况；第二个阶段是单细胞转录组测序，该技术对细胞基因表达的认识推进到单细胞的层面，目前已在新细胞类型的发现，揭示细胞异质性等方面展现出优势。但由于单细胞悬液的获得需要对组织进行酶解，悬液中的单细胞失去了组织空间位置信息，导致有些单细胞在酶解过程中或离开特定微环境后，基因表达谱会发生变化，且某些特殊形态的细胞，如大脑中结构复杂的神经元和神经胶质细胞，难以通过组织酶解获取。

然而，基因表达的位置背景对于理解组织功能和病理变化至关重要，特别是在研究细胞机制及细胞谱系发生等方面；而空间转录组测序可以同时获得细胞的空间位置信息和基因表达数据，且不需要制备细胞悬液，进一步推进了对组织原位细胞真实基因表达的研究，为组织细胞功能、微环境互作、发育过程谱系追踪、疾病病理学等多个领域提供了重要的研究手段。

空间转录组(ST)技术将鉴定的组织区域RNA分子图谱可视化，包括基于显微解剖基因表达、原位杂交、原位捕获和原位测序技术的技术。ST提供了关于转录组表达和组织在空间分辨率上相应二维位置的信息组织切片中蛋白质或mRNA的原位分析是时空分子成像的重要组成部分。病理的动态变化出现在组织器官的不同部位和同一部位内的不同细胞，而单个细胞的RNA测序不能阐明变化的转录组谱定位和细胞的空间分布。ST实验技术和生物信息学方法的发展，促进了空间转录组在临床和转化医学方面的应用。

原位杂交(ISH)通过与靶分子互补的标记探针杂交，实现了在原始环境中的可视化。原位测序(ISS)显示了细胞基因型/基因表达谱与局部环境中的形态现象之间的关系。

空间位置测序(Geo-seq)通过激光捕获显微切割(LCM)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)对组织区域的转录组进行分析，分辨率精确到10个单细胞，通量低。Geo-seq显示了组织切片特定部位的形态定义细胞的基因表达。

空间转录组(ST)提供了高通量的位置信息和分子图谱，利用空间条形码微阵列对整个组织切片的转录本进行无偏倚映射。ST结合scRNA-seq可获得单细胞分辨率下靶组织的全面3D转录组图。在ST技术的发展中，代表包括ProximID、序列荧光原位杂交(seqFISH+)、时空增强分辨率组测序(Stereo-seq)、sci-Space、空间分辨的转录扩增子读出映射(STARmap)、10× Visium、Slide-seqV2和SeqScope。

ST为了解胚胎发育过程、确定特定发育器官、早期定位和迁移的关键基因提供了新的见解。与scRNA-seq本身相比，ST提供了更好的细胞定位和发育中的细胞谱系异质性的观点。ST结合深度学习算法可以识别新的肿瘤标志物，提高临床决策的效率和准确性。

空间转录学技术原理

TECHNOLOGICAL

体内转录组分析TIVA是将寡核苷酸探针插入活细胞的一种非侵入性、空间性和精确的方法，可以从微环境中的活单细胞中捕获mRNA。TIVA通过细胞穿透肽，将一个光激活的生物素标签引入活细胞中。标签包括一段poly(U)序列和两个通过linker连接的poly(A)片段。通过对选定的区域或单细胞进行光激活，poly(U)序列暴露出来，并与细胞mRNA的poly-A尾退火。之后利用链霉亲和素与标签上的生物素相结合，可以收集捕获的mRNA，进一步用于RNA-seq。TIVA方法不适用于大量细胞的分析，而且TIVA标签只能穿透活细胞，因此它在临床样本上的用途有限。不过，第二代TIVA标签已能够穿透更深的组织。

NICHE-seq在一个特定区域（组织内拥有特定微环境的区域）内，对单个细胞的转录组进行剖析。NICHE-seq使用光激活荧光标记物、两光子激光扫描显微镜，以及利用scRNA-seq进行基于流式细胞术的荧光激活细胞分选，重建空间组织。

ProximID通过观察细胞之间的实际物理相互作用，通过在温和的条件下解离组织，从而保留包含两到三个细胞的小型相互作用结构来实现。然后手动微解剖和单个细胞作为主体进行scRNA-seq。然而，手动显微解剖使该技术有点劳动密集型，因此在通量方面是有限的。

具有可追踪标记的原位杂交技术(ISH)包括单分子荧光原位杂交(smFISH)、序贯荧光原位杂交seqFISH、多重荧光原位杂交(MERFISH)、改良连续荧光原位杂交(seqFISH+)、循环单分子荧光原位杂交(osmFISH)和RNAscope，利用标记核酸探针确定组织内细胞DNA和RNA的空间位置和丰度，可直接在原始微环境中可视化特定靶点的基因表达。

smFISH利用多条短的寡核苷酸探针（大约20 bp）杂交同一mRNA转录本的不同区域。每条寡核苷酸仅与一个荧光团偶联，因此本身的信号微弱。不过，多条寡核苷酸与同一转录本结合，就产生了可见的荧光点，并且提高了特异性。通过荧光点的计数，可以对不同的发育阶段或不同的组织样本进行比较。smFISH具有高灵敏度和高分辨率的亚细胞空间化，但显微镜下的光谱重叠限制了多个靶基因的同时检测。

seqFISH是smFISH的一种多重变体，其优势在于可以通过连续杂交、影像学检查和探针剥离重复检测单个转录本。SeqFISH技术的过程如下：在第一轮杂交过程中，荧光标记的探针与每个转录本杂交成像，然后通过DNase I处理来剥离。下一轮的杂交过程采用相同的探针序列，但探针与不同的荧光团偶联。与smFISH相比，它引入了信号放大步骤，因此信噪比提高了20倍。不过，这种方法需要大量的FISH探针，而且连续的杂交过程很耗时。seqFISH染色对整个生物体的覆盖高度依赖于致密组织中大分子的高效交换。

MERFISH从smFISH改良而来，采用了基于条形码的组合标记方法，然后进行多轮杂交，以确保荧光信号的高亮度和一次可检测到的大量RNA。MERFISH与扩增显微镜相结合扩大了RNA靶点之间的距离，检测到更多的RNA，并减少了光谱重叠。

RNAscope可同时检测多个靶分子以及分析不同类型细胞中基因表达信息与形态学分布的关系。RNAscope利用两个相邻的“z探针”，与目标 RNA 序列互补结合，实现特异性信号放大。“z探针”底端是一段长约 18-25 个碱基的序列，能够互补结合到目标RNA 上；顶端是一段14个碱基长度的序列，两个探针引物的顶端序列共同构成一段28个碱基长度的结合区，可与信号放大前体序列结合。对于任意一个目标RNA序列，都有一组独特设计的20对“z探针”，只针对该目标序列具有互补杂交特异性，而不会结合到非目标片段上。在部分RNA结合不完整或RNA部分降解等情况下，20对“z探针”的设计能够保障足够的RNA检测。形成进一步扩增分子杂交所需的结合位点，实现信号放大和减少背景。

ISS 方法通常通过基于连接（SBL）或者基于合成（SBS） 的原位测序，确定靶向基因序列或非靶向的cDNA 短片段，最终获得空间转录组信息。根据测序链接策略的不同（SOLiD，cPAL和SEDAL），基于SBL的原位测序技术方法的代表性技术分别为 FISSEQ，ISS，STARmap。

FISSEQ是一种非靶向捕获各种RNA的方法，更适用于基于原位基因表达谱的细胞类型鉴定。FISSEQ将 RNA 转化为交联的 cDNA 扩增子，然后在共聚焦显微镜上进行测序。mRNA 与邻近的大分子交联以维持其定位，在原位进行逆转录和 cDNA 扩增，从而实现 mRNA 的原位扩增测序。使用与Illumina测序兼容的原位条形码测序，BaristaSeq提高了扩增效率和测序准确性，适用于谱系追踪和绘制远程神经元投射。

STARmap是ISS的另一种方法，它使用条形码挂锁探针杂交目标，通过添加第二个引物，针对挂锁探针旁边的位点，避免了逆转录（RT）步骤，并降低了噪音。STARmap能够对完整的组织样本进行3D分析，保留了细胞的方向性，而不仅仅是单一的2D层。但需要注意的是，这种能力只表现在100-150微米厚的切片和较少的目标数量上。STARmap能够对单细胞中1020个目标基因成像，检测效率与单细胞RNA测序相当。

 2018年底，ST技术被10x Genomics公司收购并进一步开发，命名为 "10x Visium"。10x Visium检测法在分辨率（直径55µm，条形码区域之间的距离更小）以及运行时间上都有改进。Slide-seq代替在玻片上打印区域条形码RT引物，它利用放置在载玻片上的随机条形码珠子来捕获mRNA。在Slide-seq方法发表后不久，另一种使用更小的条形码珠子的技术发布，命名为高分辨率空间转录组技术（HDST）。

HDST通过在载玻片表面雕刻 2.05 μm 的大量小孔，将直径为 2μm 的硅胶磁珠分配到这些孔里，通过在磁珠表面连接带有特定 barcode 序列以及多种 UMI 和 poly-dT 的寡核苷酸链，来捕获对应位置细胞的 mRNA 进行反转录，并进行文库构建和转录组测序。

APEX-seq是一种RNA直接邻近标记技术。APEXseq利用抗坏血酸过氧化物酶提供转录组的空间和定位信息。

DBiT-seq通过基因编码的过氧化氢酶APEX2在H202催化1分钟后，直接在活细胞内对指定区域（利用特异性融合蛋白或定位信号将APEX定位在目标区域）的RNA进行高精度的生物素标记，然后利用链亲和素修饰的磁珠对标记的RNA进行富集后进行深度测序。

目前，空间转录组技术大多数情况下还只是应用于基础研究，但这些技术可能会成为个性化医学的重要工具。技术发展的一个驱动力是一些正在进行的大型合作研究，以创建全面和公开可用的数据集。同时，需要建立新的分析工具和标准化程序，以便能够将所有这些不同的技术结合起来，每种技术都有其独特的特点、数据格式、优势和注意事项。空间转录组学领域正在加速技术进步，而这一进展使许多生物学分析成为可能。 

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