28+单细胞用户文章发现新的脂质积累的反应性星形胶质细胞可促进癫痫疾病进展|单细胞专题

癫痫（epilepsy）即俗称的“羊角风”或“羊癫风”，是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。据中国最新流行病学资料显示，国内癫痫的总体患病率为7.0‰，年发病率为28.8/ 10 万，1年内有发作的活动性癫痫患病率为4.6‰。其中伴有海马硬化的颞叶性癫痫患者（temporal lobe epilepsy, TLE）很可能会发展为药物难治性癫痫。TLE患者致痫区的两大主要病理学特征是神经元死亡和胶质瘢痕的产生，胶质瘢痕的主要细胞成分是反应性星形胶质细胞（reactive astrocyte）。反应性星形胶质细胞在老年痴呆症、多发性硬化症等多种神经系统疾病中被发现，且与疾病进展密切相关。然而，在TLE中，反应性星形胶质细胞的功能尚不清楚。

近日，在《Nature Neuroscience》上发表的一篇文章报道了最新的研究进展。这项研究首次揭示颞叶性癫痫患者大脑中存在一种全新的反应性星形胶质细胞亚型，其显著病理特征是星形胶质细胞存在异常的脂质堆积；这些脂质堆积的反应性星形胶质细胞（lipid-accumulated reactive astrocyte, LARA）以依赖APOE的方式形成，表现出独特的脂代谢和脂转移相关的分子表达谱。并通过上调腺苷受体表达，减少对谷氨酸的重摄取，从而加剧神经元的兴奋性，促进颞叶性癫痫的疾病进展。

论文标题：Lipid-accumulated reactive astrocytes promote disease progression in epilepsy

刊登日期：2023年03月

发表杂志：Nature Neuroscience

影响因子：28.771

研究机构：南京大学生命科学学院

技术手段：snRNA-seq、Bulk RNA-seq、脂质代谢组测序

01颞叶癫痫患者脑内脂质异常蓄积研究

首先作者在对TLE患者的磁共振检查中，注意到患者病灶侧出现异常脂堆积的现象（图1a）。进一步的组织化学染色（图1b，c）、脂质代谢组学数据（图1d，e和图2c，d）、免疫荧光（图1f）共同表明，致痫灶中的异常脂质堆积是耐药性TLE患者的一个重要病理特征，并且脂质异常堆积主要发生在神经元和星形胶质细胞中。上述临床观察结果在经典红藻氨酸(KA)诱导的小鼠癫痫模型中得到证实（图1g-k）。

图1

02单核RNA测序在颞叶癫痫患者中的应用

为了探究异常的脂堆积是否会导致脂代谢相关基因的表达变化，作者收集了4例耐药性TLE患者和4例与之年龄匹配的正常人脑组织样本进行了单核RNA测序（snRNA-seq）分析，总共获得了66,526个单核转录图谱(图2a)，聚类分析确定了具有关键代表性标记基因的九种主要细胞类型（图2b、c）。细胞群体分析显示，在TLE参与者和非TLE对照组之间有很大的差异，TLE参与者的抑制性神经元减少，胶质细胞增加（图2d）。星形胶质细胞由典型标志物GFAP、FGFR3、GJA1、AQP4和ALDH1L1(参考文献)的表达来定义（图2e）。GO分析结果发现TLE患者的神经元、星形胶质细胞都存在脂代谢和转运的信号通路异常激活，其中星形胶质细胞尤为显著（图2f），并且APOE在星形胶质细胞中显著高表达（图2g，h）。作者通过免疫荧光和免疫印迹法对上述结果进行了证实（图2i，j）。并且作者发现，在KA诱导的癫痫小鼠的海马星形胶质细胞中，APOE的表达也显著上调（图3a-c）。

图2

03APOE介导了从神经元到星形细胞的脂质转移

为了探究APOE高表达是否是星形胶质细胞脂质堆积的必要条件，研究人员对野生型颞叶性癫痫小鼠和APOE敲除的癫痫小鼠海马区脂堆积情况进行了比较，发现APOE敲除对神经元内的脂堆积没有明显影响，但是，却显著地阻断星形胶质细胞上的脂堆积（图3d-g）。于是，他们提出了假说：在慢性癫痫条件下，脂质首先在神经元中堆积，星形胶质细胞来源的APOE将脂质转运进星形胶质细胞内，造成了星形胶质细胞的脂堆积。进一步的离体神经元-星形胶质细胞共培养实验，星形胶质细胞APOE特异性敲除的癫痫小鼠模型实验对这一假说进行了验证（图3h，i和图4）。

图3

图4

04颞叶癫痫患者反应性星形胶质细胞的分子图谱

那么这群高表达APOE并且脂异常堆积的星形胶质细胞是否是一种特定的星形胶质细胞亚群？在癫痫中的作用是什么？研究人员对单核RNA测序数据进行进一步分析，并将星形胶质细胞集群分为6个亚群，其中有一个亚群中脂质代谢和转运相关的基因显著高表达功能，该亚群也表现出最高的APOE表达水平，该亚群的转录组特征与之前已报道过的反应性星形胶质细胞亚型的转录特征都不一样，是一个全新的亚型，因此，他们定义这个亚群为脂堆积的反应性星形胶质细胞，并命名为LARA（图5）。APOE与LARA形成之间存在什么联系？作者对野生型颞叶性癫痫小鼠和APOE KO颞叶性癫痫小鼠海马区进行了转录组测序，发现APOE KO逆转了绝大部分LARA相关基因的表达水平，证明APOE是LARA形成的必要条件（图5g）。

图5

05LARA具有促癫痫的作用

接下来，他们对LARA在颞叶性癫痫中的功能表型进行了探究，发现不论是APOE KO还是APOE cKO，都能够改善颞叶性癫痫小鼠的癫痫发作次数和持续时间以及离体脑片的癫痫样事件的发生次数和持续时间（图6a-f）。与此相一致，用CDP-胆碱（一种已知可降低星形胶质细胞中LD和TG水平的脂代谢加速器）治疗癫痫小鼠，有效地减少了KA刺激的野生型小鼠的癫痫发作活动(图6g，h)，说明LARA具有促癫痫的作用。

图6

06脂质堆积的反应性星形胶质细胞通过星形胶质细胞A2AR促进癫痫发作活动

最后，他们还探究了LARA促癫痫的潜在机制，发现LARA通过腺苷A_2AR来发挥促癫痫作用，不论是使用抑制剂抑制腺苷A_2AR，还是使用病毒特异性敲低星胶上的腺苷A_2AR，都能够改善颞叶性癫痫小鼠的癫痫发作次数和持续时间以及人脑切片的癫痫样事件的发生次数和持续时间。

图7

总结

综上，这项研究发现TLE患者病灶区存在异常脂堆积现象，定义了一种全新的反应性星形胶质细胞亚型——LARA，并系统研究了LARA在TLE中的分子表型和功能表型；同时首次揭示了APOE在癫痫疾病进展中的作用。通过该研究表明，通过干预脂质运输和调控脂代谢靶向LARA，或能为耐药性癫痫提供全新治疗策略。

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