单细胞多组学专题：人脑前额叶背外侧皮质空间基因表达谱

文章题目：Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex

发表时间：2021.02

发表期刊：Nature Neuroscience

影响因子：28.771

所用组学：snRNA-seq、空间转录组

研究背景01

大脑的空间组织与其功能有着根本的联系，这种结构-功能关系在人类大脑皮层的层状组织中尤为明显，在不同皮质层的细胞有着不同的基因表达模式，并表现出不同的形态学、生理学特性。

研究正常的大脑发育以及中枢神经系统疾病需要识别构成大脑的细胞类型，并将细胞类型的功能与结构联系起来。由于与神经精神障碍相关的病理学和基因表达的一些差异局限于特定的皮质层，因此以单细胞分辨率来定位人脑中基因空间表达状态对于进一步了解疾病机制至关重要。

研究结果02

本研究共收集了3个神经功能正常的捐献者死后脑组织，选取前额叶背外侧皮层，垂直脑表面取样2对切片，每对包含直接相邻的2张切片。通过在每个组织切片中使用灰质/神经元（SNAP25）、WM/少突胶质细胞（MOBP）和L5 （PCP4）标记基因描绘第6层（L6）与邻近白质（WM）和识别层（L5）之间的边界来确定每个样本的方向。

01空间转录组数据

本研究共收集了3个神经功能正常的捐献者死后脑组织，选取前额叶背外侧皮层，垂直脑表面取样2对切片，每对包含直接相邻的2张切片。通过在每个组织切片中使用灰质/神经元（SNAP25）、WM/少突胶质细胞（MOBP）和L5 （PCP4）标记基因描绘第6层（L6）与邻近白质（WM）和识别层（L5）之间的边界来确定每个样本的方向。

02DLPFC不同皮层的基因表达

将每个空间复制生成聚集的层富集的表达谱，使用“有监督”方法将单个点分配给六皮层或白质。然后通过在每一个空间复制中对该层每个基因的UMI计数求和进行“伪bulk”，从而产生层富集的表达谱。组织学图像证实了在L1中细胞个数较少，其中33.4%和21.7%的点包含0和1个细胞。在富含少突细胞的WM中，则观察到细胞密度增加，分别有3.9%和5.9%的Spot含有0和1个细胞。并用三种方法来分析差异基因，分别为“ANOVA”模型、“富集”模型、“成对”模型。

03在大脑皮层中鉴定新的富集层基因

首先作者评估了这些先前识别的标记基因在人类DLPFC层富集基因表达数据集中的稳定性。将先前发表的层富集基因作为一个基因集，在该研究的层富集DEGs中发现强富集。

因为很多标记基因注释多层（例如CCK和ENC1）而不是在DE分析中发现的单一层，所以通过富含层的表达谱为每个基因拟合“最佳”统计模型。并且作者进一步证实了许多典型标记物基因(包括 CCK，ENC1，CUX2，RORB 和 nTNG2)的层状富集，并根据人脑图谱的公开的原位杂交数据进行了验证。

作者鉴定出了之前没有报道过的 FABP7, ADCYAP1, PVALB 等层富集基因，它们没有被Allen Brain Institute的资源归类为层标记，并且通过原位杂交（ISH）和多路单分子荧光原位杂交（smFISH）技术也印证了空间转录组的鉴定出的新层富集基因。

04snRNA-seq的空间定位

从“富集模型”导出的层富集表达谱和差异表达统计用于snRNA-seq数据集的空间定位。作者首先使用之前的发表的snRNA-seq 数据来确认富含层的表达谱，并进行验证。

尽管该研究中的 snRNA-seq 数据主要来自从人死后中颞叶皮层中神经元的细胞核，但是空间组织切片层富集的DEG与这些细胞核来源的层分配相一致。作者通过人类脑前额叶外皮的RNA-seq 数据进行验证。

随后层富集的统计数据对人类皮层的三个独立snRNA-seq数据集进行空间定位，分别是作者从两个人类的DLPFC 中测得的snRNA-seq 数据，自闭症谱系障碍（ASD）研究中包括来自31个人体的41个样本的snRNA-seq数据以及阿尔茨海默病研究中来自48个人的snRNA-seq数据。 

其中胶质细胞亚群出现明显的富集，在WM中优先表达少突胶质细胞亚型，在L1中优先表达星形胶质细胞亚型，在L1和WM中优先表达小胶质细胞、少突胶质细胞前体(OPC)、周细胞和内皮亚型，多种兴奋性和抑制性神经元细胞类型与L2/L3、L4、L5和L6优先表达相关。

05富集基因表达谱的临床相关性

作者通过几种不同的大脑疾病相关基因组来评估空间基因表达的临床相关性。首先通过DNA分析评估了来自与不同疾病相关的基因的基因组的层面富集，随后分析了在多种脑部疾病患者与对照组大脑中差异表达的基因，以及转录组范围关联研究(TWAS)与遗传风险相关的基因。

最新的SFARI基因数据库证明L2、L5和L6与869个ASD风险基因的富集。WES数据证实了L2和L5与102个具有ASD相关变异的基因的关联。并根据临床症状对这些基因进行分层可以细化分层富集，因为与ASD显性性状相关的53个基因对L5更富集而与神经发育迟缓相关的49个基因对 L2更富集。

通过对两个大型SCZD数据集中鉴定的DEGs的富集分析，发现与对照组相比，患者中L1、L2和L3基因的表达增加，WM、L4、L5和L6基因的表达减少。通过评估TWAS数据没有发现任何层富集基因表达的TWAS信号的强富集，但L2和L5的SCZD风险基因表明患者的表达减少。

06通过DLPFC数据进行聚类

作者分别构建了3种“非监督”、“半监督”、“监督”的数据聚类方法，“监督”方法从基于细胞结构的层的手动注释中识别层富集的DEG，这种方法同样适用于大脑的其他区域或者其他的组织。非监督方法可用来分析空间结构不明确的组织，特别是那些与抑制神经元亚群、脑血管系统或免疫功能相关的组织。随后作者使用调整后的兰德指数(ARI)作为性能指标来评估三种方法，ARI具有更高的值对应于更好的性能，发现在所有三种方法中，“半监督”方法的 ARI 最高。

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