单细胞+mRNA疫苗=Nature|单细胞专题
论文标题：Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer
刊登日期：2023年05月
发表杂志：Nature
影响因子：69.504
技术手段：单细胞免疫组测序
研究背景
PDAC（胰腺癌）是全球癌症死亡的第七大原因之一，且伴随着不良的预后效果。由于大多数PDAC都含有具有刺激T细胞潜力的新抗原，传递新抗原的策略可能会诱导新抗原特异性T细胞并影响患者的预后。
且先前的研究表明PDAC的长期幸存者对患者中不共享的肿瘤特异性新抗原产生了自发的T细胞反应。因此，通过假设一种有效的个体化mRNA疫苗可以在PDAC中诱导新抗原特异性T细胞，消除微转移，延迟复发。
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2实验设计
作者一共纳入了34例患者，其中28例患者接受了手术。19例患者使用了atezolizumab，其中16例患者随后接受了autogene cevumeran治疗。16例患者中有15例也接受了随后的mFOLFIRINOX治疗。
研究结果
1. 免疫原性及安全性分析
在安全评估队列中，接受atezolizumab单抗治疗的19例患者中均未出现3级或更高级别的不良事件（图1c）；16名患者中有1名患有3级不良事件；安全性能较高。因此，autogene cevumeran即使在复杂的肿瘤手术后，也可以快速使用。
接下来，作者采用IFNγ ELISpot测量了autogene cevumeran诱导的T细胞反应，结果表明16名接受疫苗的患者中有8名（50%）产生T细胞应答，并被认为是autogene cevumeran应答者（图1e）。
通过测试新抗原疫苗中包含的每个特定靶点，作者检测到在单靶标水平可评估的所有患者中，230种新抗原中有25种诱导了足够高的T细胞反应（图1e）。所有接受疫苗的患者中有一半对至少一种新抗原疫苗产生了新抗原特异性T细胞反应。所有接受疫苗的患者中有一半对至少一种新抗原疫苗产生了新抗原特异性T细胞反应。
此外，这些应答中有一半是多变性的，针对不止一种新抗原疫苗（图1e，f）。体外IFNγ ELISpot免疫接种前未检测到T细胞对疫苗新抗原的反应（图1f）。疫苗接种后检测到的新抗原特异性免疫反应水平从每百万外周血单个核细胞约100个spots到大于2000个spots不等（图1g）。观察到所有反应的数量和强度在患者间的差异，以及患者内多囊反应强度的差异。因此，在很大比例的PDAC患者中，autogene cevumeran诱导了大量的新生T细胞反应。
图一：个体化mRNA新抗原疫苗在PDAC患者中是安全、可行和免疫原性的
2. T细胞克隆型和表型
通过新开发了CloneTrack探索autogene cevumeran T细胞克隆的多样性和特异性；作者在8例应答者中的8例和8例无应答者中的1例中检测到疫苗诱导的克隆扩增（图2a，b）。在应答者中，autogene cevumeran 将多个克隆从无法检测到的水平扩展到所有血液T细胞的10%。
为了评估autogene cevumeran T细胞克隆的抗原特异性，作者在体外鉴定了免疫显性新抗原特异性的T细胞克隆，并在体内检测了2例单一反应患者和2例多位反应患者与autogene cevumeran T细胞克隆的克隆重叠。4个患者中有3个和51%的疫苗扩增的高规模克隆含有免疫显性新抗原特异性克隆（图2e）。因此，autogene cevumeran 在PDAC中扩展了新生多克隆新抗原特异性T细胞。
通过单细胞RNA测序发现autogene cevumeran的高数量级克隆是CD8+ T细胞，表达裂解标记物和细胞因子(IFNγ)，类似于保护性病毒疫苗诱导的效应T细胞。同样，接种疫苗后收集的外周血样本含有多功能CD8+ T细胞，但不含CD4+ T细胞，这些细胞产生细胞因子(IFNγ和TNF)，并在体外用长新肽和MHCI-restricted最小的抗原表位在体外再激发时进行颗粒化处理（图1g和h）。
尽管接种mFOLFIRINOX疫苗后，autogene cevumeran扩增的T细胞仍保持持续的IFNγ产生的功能（图1f），在所有应答者中使用统一的疫苗增强剂，在手术后2年内所有血液T细胞中有2.5%的细胞持续存在（图2c）。
此外，疫苗增强剂在接受增强剂的7名患者中重新扩增了相同的引物克隆。总的来说，autogene cevumeran大量扩增T细胞，包括疫苗新抗原特异性、功能性和持久性CD8+ T细胞。
图二：mRNA疫苗扩增多克隆、多功能效应CD8+T细胞
3. 疫苗反应和临床结果
在可评估生物标志物的队列中，8例autogene cevumeran应答者的中位无复发生存期（RFS）未达到，而8例无应答者的RFS为13.4个月（图3b）。与无反应者相比，反应者的血清CA19-9水平持续较低，CA19-9是最广泛使用的临床PDAC生物标志物。
我们发现对atezolizumab的应答、淋巴结阳性、原发肿瘤大小、化疗剂量数量和瘤内CD8+ T细胞密度与疫苗应答无关。有应答者和无应答者也具有相当的免疫适应度。总之，autogene cevumeran扩增T细胞反应与延迟PDAC复发相关，这不会被患者选择、肿瘤内T细胞频率或外周T细胞频率或健康状态的可检测到的差异混淆。
由于autogene cevumeran诱导应答者对106种疫苗编码新抗原中的25种产生高强度的T细胞应答，因此作者进一步寻找与疫苗应答的相关因素。作者之前的研究显示CD8+T细胞富集的PDAC肿瘤也富集于免疫原性“高质量”新抗原，在肿瘤克隆中分布的比例更大。因此，作者研究了肿瘤的克隆性和新抗原质量是否与疫苗诱导的T细胞应答相关。
同样，对autogene cevumeran有应答的人比无应答者有更多的克隆性肿瘤。因此作者检测了应答者中的免疫原性新抗原是否具有高质量的特征。通过对之前的模型进行分析发现，该模型可以识别肿瘤中自发靶向的新抗原，以将免疫原性与接种的新抗原的质量相关联。在应答者中，新抗原质量作为一个连续变量，与诱导IFNγ ELISpot应答的疫苗新抗原相关。无应答者与有应答者有相似数量的非同义突变和疫苗新抗原。
图三：mRNA疫苗应答与PDAC延迟复发相关
4. 疫苗克隆和微转移
第29例患者对autogene cevumeran有应答，其扩增的血液T细胞百分比第二高（图2b），其中包括疫苗新抗原特异性多功能CD8+ T细胞。患者29血清CA19-9水平升高，并出现新的7mm肝脏病变，提示接种疫苗后发生转移（图4a）。活检样本未发现恶性细胞，但有密集的淋巴浸润，包括所有15例autogene cevumeran扩增CD8+T细胞克隆，表型证据表明具有溶解和效应潜力（图4b）。
Droplet PCR显示，淋巴细胞浸润含有罕见的携带TP53R175H突变的细胞，与该患者原发肿瘤中的R175H驱动突变相同（图4c）。该肝脏病变在随后的成像中消失（图4a），这表明autogene cevumeran扩张的T细胞可能具有根除微转移的能力。
图四：疫苗扩增的T细胞可以浸润微转移
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