生命在于运动---磷酸化组学揭示运动与骨骼肌中激酶网络
蛋白质磷酸化是生物体内表达调控的关键环节，对许多生物的功能调节起开关调控作用，是一种普遍的重要调节机制。运动在体内代谢稳态中起着至关重要的作用，它是预防和治疗某些代谢障碍的较为有效的疗法。不过，大多数关于肌肉运动信号的研究都集中诸如AMPK、PKA等蛋白的磷酸化单一有限的范围通路内，而很少有针对运动所调控激酶的信号网络研究。
2015年，Nolan J. Hoffman等人发表在国际著名期刊Cell Metabolism上的研究成果填补了这一空白。研究者采用磷酸化蛋白质组学方法进行定量分析比较，揭示了骨骼肌中激酶网络，同时证实了磷酸化修饰对线粒体呼吸关键信号的调节作用。
1.定量磷酸化蛋白质组学分析运动前后样本差异
为了研究磷酸化作用对运动的关键性调节作用，研究人员首先利用定量磷酸化蛋白质组学分析4个受试者运动前和运动后肌肉活检组织样本。在4组样本中均被定量的总共有8511个磷酸化位点和4317个蛋白质，且鉴定到剧烈运动显著调节有关的1004个磷酸化位点。在剧烈运动调控的1004个磷酸化位点中，有592个位点已被磷酸化数据库注释（霍恩贝克等人，2012年），412个位点没有注释信息。
图1 运动前后的定量磷酸化蛋白质组学分析
2.磷酸化蛋白数据库注释磷酸化位点对应的上游激酶信息
研究者发现，剧烈运动调控的592个磷酸化位点中，只有66个蛋白的79个磷酸化位点与上游激酶得以验证，其中由15个激酶组成的运动所调节的激酶调控有两个或更多的底物：AMPK,MAPKAPK2 p38 MAPK等。研究者对这些受运动调节的激酶进行蛋白激酶互作网络的分析，揭示了运动信号的复杂性和相互关联性（图2）。
图2 运动调节的蛋白激酶互作网络
3. SILAC磷酸化蛋白质组学方法，鉴定AMPK底物
AMPK是能量“传感器”，在运动调节通路中被广泛的研究。在之前的研究中通过磷酸化数据库匹配，只对应到6个AMPK激酶底物，且有相当一部分磷酸化底物没有匹配到相应的上游激酶。为了得到更多地鉴定AMPK底物，研究者用SILAC磷酸化蛋白质组学方法，对非磷酸化肽进行量化，以研究蛋白质丰度的变化。总共鉴定出12 695个磷酸化位点，且7,421个磷酸化位点在两回四次生物复制中均被定量。其中有已知的AMPK底物：包括TBC1D1的S231，ACC1的S79，ULK1的S637，AMPKb1上的S108(图3)。
图3 SILAC磷酸化蛋白质组学鉴定AMPK底物
4. AKAP1与线粒体AMPK信号通路
为了检测AKAP1在线粒体AMPK信号中所起的作用，研究者用磷酸化特异性抗体检测AMPK底物AKAP1的磷酸化。结果显示，AMPK为AKAP1- pS103的激酶，可增加AKAP1 S103磷酸化，与AMPK增加ACC S79的磷酸化类似，该增加效应能够被复合C所废除。
研究者使用老鼠运动锻炼模型为样本，WB实验检测磷酸化，发现剧烈运动增加了AKAP1-pS103，AMPK-pT172和ACC-pS79的表达。随后免疫荧光实验证实AKAP1 -WT和AKAP1- S103A突变体主要定位于线粒体中。最后研究者测定线粒体的呼吸率以及氧气消耗率，结果表明AMPK对底物AKAP1-pS103有助于线粒体的呼吸。
图4 AKAP1与线粒体AMPK信号通路
研究者运用磷酸化蛋白组学技术，研究关于人类骨骼肌剧烈运动信号传导的磷化分析，揭示了运动信号网络的复杂性。通过结合磷酸化蛋白质组学、AMPK SIALC磷酸化蛋白质组学、DIA-MS靶向技术验证以及生物信息学分析，确定了8个高度预测的AMPK底物，涉及到线粒体功能、囊泡运输，以及兴奋收缩偶联等途径。其中底物AKAP1通过AMPA依赖的磷酸化过程来调控线粒体的呼吸链，由此强调了运动能够调节线粒体的磷酸化。这些数据对于剧烈运动所调节骨骼肌新陈代谢的机制研究，具有重要的启示作用。
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