Nat Immunol:蛋白质组学揭示T细胞活化中的非降解型泛素化修饰
景杰学术/解读
CD4+T细胞是一类重要的免疫细胞，其在免疫反应过程中扮演着重要的角色。众所周知，CD4+T 细胞的活化需要双信号，其中抗原提呈细胞的MHCⅡ类分子与TCR/CD3复合受体结合产生第一信号，B7分子与CD4 +T 细胞的CD28结合产生协同刺激的第二信号。在双信号作用下，T细胞识别抗原的活化信号被传递到细胞内，启动细胞内的活化过程，使CD4 +T细胞活化、增殖并分泌IL-2 等细胞因子，而IL-2 进一步刺激CD4 +T细胞增殖分化，并引起相应的生物学效应。CD4 +T细胞表面的CD3和CD28分子是活化信号传递过程中最直接也是最为重要的两个分子，其表达变化直接影响着信号向细胞内传导的强度。
泛素化是单个或多个泛素在泛素激活酶、泛素结合酶及泛素蛋白连接酶的作用下共价修饰底物蛋白质的过程。在蛋白质降解的过程中,泛素化标记被蛋白水解酶体特异性识别,发挥着枢纽的作用。而近年来的研究发现，泛素化不仅仅是蛋白质降解的标志,它还具有更为广泛的用途,参与了大量的生命活动。尽管有证据表明泛素化可以指导非降解结果，但大多数关于T细胞泛素化的研究都集中在降解上，所以揭示清楚T细胞泛素化其他非降解功能则具有相当重要的意义。
近日，来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院和费城儿童医院的Paula Oliver 博士课题组在著名学术期刊Nature Immunology (IF:21.809)上发表论文，利用蛋白质组学等技术揭示了T细胞中泛素化的非降解功能。文中，研究人员整合了来自小鼠原代CD4+ T细胞的蛋白质组、转录组和泛素化组学的数据集，以建立预测泛素化的降解或非降解结果的框架。
研究表明CD4 + T细胞的活化导致非降解泛素化的增加，并确信这与非蛋白酶体靶向的K29，K33和K63多聚泛蛋白链的增加相关。同时，该研究总共揭示了1200多种在原代小鼠CD4 + T细胞中泛素化的蛋白质，并突出了非蛋白酶体靶向泛素链在T细胞信号传导中的相关性。
1、原代CD4 + T细胞的蛋白质组与转录组分析
作者用IL-2 处理小鼠的原代CD4+ T细胞72小时，随后再使用CD3 + CD28抗体处理4小时，对照组为“静息”处理。对处理后的细胞进行全蛋白质组分析（WCP）和转录组分析。
全蛋白组学分析从CD4 + T细胞中共鉴定到5500多种蛋白质，并且有4556种蛋白质能在三组实验中被共同鉴定到（占总蛋白质的71％）（图2a）。与对照组相比，使用CD3 + CD28抗体处理后279种蛋白质丰度显著增加，342种蛋白质丰度显著下降（图2b）。将蛋白质组数据与转录组学数据进一步比较，证实了两者确实存在很差的相关性（图2c）。
图2 CD4 + T细胞的全细胞蛋白质组与转录组分析
二、泛素化蛋白质组学分析
研究者接下来使用双甘氨酸富集策略（Di-glycine profiling），鉴定活化的CD4 + T细胞中的泛素化程度变化。研究对1200多个泛素化修饰蛋白进行了精确定量，其中很多细胞抗原受体通路的相关蛋白都被鉴定到具有泛素化修饰（图3d）。CD3 + CD28抗体刺激后，221个蛋白质的泛素化增加，217种蛋白质的泛素化作用减少。其中有43个蛋白质仅在CD3 + CD28刺激的CD4 + T细胞中存在，121种蛋白质仅在静息CD4 + T细胞中发生泛素化（图3e）。总体而言，泛素化的变化与总蛋白质丰度没有显示出强烈的负相关性，这也使作者得出结论，TCR诱导的泛素化的变化通常与降解无关。
三、非降解型泛素化修饰在T细胞活化过程中的潜在调控作用
作者进一步比较了泛素化修饰变化和蛋白丰度的变化，研究发现涉及到TCR途径中的12种蛋白质表现出泛素化的增加，并且预测到NFKB1，UBE2N，ZAP-70和LAT发生降解泛素化。CD3ε，CD3γ，CD3ζ，PKCθ，CDC42，RAC1，RHOA和GRAP在RNA和相应蛋白质的表达中表现出相似的变化，结果表明它们的泛素化不会导致蛋白质降解（图4a）。
根据用于分析TCR信号通路的预测框架，研究者进一步发现了基础泛素化对于大约51％的泛素化蛋白具有可预测的降解结果，大约65％的泛素化蛋白质的可预测非降解结果显著高于基础泛素化预测的比例（图4b）。当评估‘再刺激’的CD4 + T细胞中蛋白赖氨酸二甘氨酸肽的相对丰度的平均变化时，他们发现K29，K33和K63肽相对于‘静息’的CD4 + T细胞可再现性地增加。与静息的CD4 + T细胞相比，再刺激的CD4 + T细胞中与蛋白酶体降解相关的K48和K11在蛋白残余肽的丰度没有变化（图4c）。总之，该分析表明活化的CD4 + T细胞中非降解性泛素化作用的增加与非蛋白酶体靶向的遍在蛋白链的增加相关。
总而言之，研究者通过运用多维组学技术，结合了RNA测序，蛋白质组学和泛素化蛋白质组学，实现了对T细胞中5500个蛋白的精确定量，和原代小鼠CD4+ T细胞中1200多种蛋白泛素化的变化。研究者进一步将泛素修饰丰度与全细胞蛋白组学和转录组学数据进行比较，生成一个预测框架来分析泛素化与蛋白质丰度之间的关系。他们的结果确证了TCR刺激后泛素化增加的蛋白更有可能表现出非降解泛素化，并相信这与K29，K33和K63蛋白残余肽的增加一致，这也为揭示T细胞泛素化其他非降解功能提供了重要的理论支撑。
参考文献
Dybas JM, et al., 2019, Integrative proteomics reveals an increase in non-degradative ubiquitylation in activated CD4(+) T cells. Nat Immunol.
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