宏蛋白质组学最新综述——评估微生物群落成员时空结构、代谢和生理的强力工具
景杰学术/解读
编者按：今天为大家解读于2019年5月21日在线发表在国际专业学术期刊mSystems杂志上（IF=6.519）由美国北卡罗来纳州立大学植物和微生物生物学系Manuel Kleiner所撰写的宏蛋白组学综述。文中概述了宏蛋白质组学目前可以用于解决的科学问题，以及正在开发的基于宏蛋白质组学的新方法。
宏蛋白质组学( Metaproteomics )是对微生物群落中的蛋白质进行大规模定性和定量，从而在分子水平上揭示微生物表型信息的一门学科。自2004年宏蛋白质组学的概念提出以来[1]，PubMed只有约500篇文章涉及宏蛋白质组（相比之下宏基因组学则大于1万篇）。但在2012年之后，宏蛋白质组学的文章数量则呈现了指数级增长。一部分原因是相关技术和方法发生了质的飞跃：其中包括出现了能够分离高度复杂肽混合物的液相色谱，能够获得大量精确质谱信息的高分辨率质谱仪，以及能够处理和分析复杂数据的计算机工具。
例如，2004年时标准方法是通过二维凝胶（2D-Gel）电泳分离蛋白质，然后手动挑选单个蛋白质点进行质谱分析，这种方法费时费力且通量较低；而现在通常使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）来实现数万个肽段的鉴定和定量，单个样本甚至可打到1万以上的蛋白质。液相色谱和高分辨率质谱技术的进步推动了新的宏蛋白质组学方法的发展，使研究人员能够解决一系列问题。
虽然宏蛋白质组学经常依赖于其他方法——例如，首先需要宏基因组测序建立参考数据库，通常是宏蛋白质组学的先决条件[2]。但不可否认，宏蛋白质组学是研究微生物群落时空表征的有效方法之一。借助一个精确的蛋白质序列数据库，人们可以知道这些蛋白质属于哪个物种（或更高级的分类群，如属、科等），并进一步理解群落中不同成员的功能角色和相互作用。
由于蛋白质是维持细胞功能的直接效应子，检测它们的丰度有助于在分子水平上解析细胞的表型信息。例如，有一种海洋蠕虫，其所需的全部营养来自五种共生菌，但起初人们并不知道这些共生菌会利用哪些环境能源来进行碳固定。一项宏蛋白质组学研究发现，某些共生菌会大量表达一氧化碳脱氢酶，这暗示它们可能利用一氧化碳作为能量来源，随后的生理培养实验和纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）的测量结果也证实了这一假设[3, 4]。
图1、宏蛋白质组学目前能够解决的问题
宏蛋白质组数据除了可用于识别不同人工或自然环境下单个基因表达的变化[5]，还可以通过计算每个成员的生物量来分析群落结构[6]。此外，宏蛋白质组学方法产生的高分辨率质谱数据也可以用来分析某个蛋白质和物种的同位素含量。例如，作者开发了一种高灵敏度的蛋白质稳定同位素指纹图谱法来分析碳稳定同位素的天然比率。该方法能够确定微生物群落中的每种微生物的碳源，以及自养微生物的碳同化途径[7]，并且比其他方法（如NanoSIMS和DNA-SIPS）具有更高的分辨率和通量。
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研究者还提出了未来基于宏蛋白质组学可开发出的新技术方法来解决新问题。这些方法包括：
（i）使用高灵敏度的、基于蛋白质的稳定同位素探针（Protein-SIP）来跟踪微生物群落中碳、氮、氧和氢的流动；
（ii）使用蛋白质周转率来估计群落成员的生长率；
（iii）使用基于活性的蛋白谱以及探针来表征具有特定酶功能的未知蛋白；
（iv）以更高的灵敏度检测环境病毒；
（v）区分环境样品中细胞结合的蛋白质和细胞外蛋白质（包括分泌的和残余的蛋白质）。
最后，作者提出了推动宏蛋白质组学发展的几个关键因素。其中包括新技术的产生、宏蛋白质组学方法的人员培训、实验方法的验证和标准化、定制型计算工具的开发以及举办专门的宏蛋白质组学会议等。
技术革新是最直接有效的方式。限制宏蛋白质组学通量的技术因素之一是单位时间内仪器能够获得的谱图数量。目前大多数的质谱仪每小时最多检测4万个谱图，因此需要花费数小时的仪器时间来进行全面深入的群落分析。新一代质谱仪具有更高的测量频率，能够显著提高宏蛋白质组的通量。如作者提到2018年12月德国马普生化研究所所长Matthias Mann教授发表在蛋白质组学领域顶级期刊MCP上的研究，结合了离子淌度和飞行时间质谱的timsTOF Pro质谱仪，能够在1小时内测量60万个谱图，实现更快速度、更高灵敏度、更强大的4D蛋白质组学分析[8]。
图2、新一代质谱仪具有更高的分辨率、灵敏度和扫描速度（杭州景杰生物科技有限公司是国内唯一引入timsTOF Pro质谱仪的公司，目前已完成调试并正式投入使用）
在过去几年中，进行宏蛋白质组学研究的实验室数量稳步增加，导致对专门处理这类数据的生物信息学工具的需求增加。虽然大部分数据可以用标准蛋白质组工具进行分析，但是也有专门为宏蛋白质组数据的工具相继被开发，如MetaProteomAnalyzer[9]、Unipept[10]和Calis-p[7]。预计这一趋势仍会持续下去，更多工具将会出现。
此外，研究团队数量的增加也促使宏蛋白质组方法需要更好的验证和标准化。目前对于不同问题或样本类型所使用的方法上并没有统一标准，因此要实现宏蛋白质组在实验室之间更广泛地应用和比较，还需付出更多的探索和努力。
参考文献
1. Wilmes P, et al., 2004, The application of two-dimensional polyacryl- amide gel electrophoresis and downstream analyses to a mixed com- munity of prokaryotic microorganisms. Environ Microbiol.
2. Tanca A, et al., 2016, The impact of sequence database choice on metaproteomic results in gut microbiota studies. Microbiome.
3. Kleiner M, et al., 2012, Metaproteomics of a gutless marine worm and its symbiotic microbial community reveal unusual pathways for carbon and energy use. Proc Natl Acad Sci U S A.
4. Kleiner M, et al., 2015, Use of carbon monoxide and hydrogen by a bacteria-animal symbiosis from seagrass sediments. Environ Micro- biol.
5. Hamann E, et al., 2016. Environmental Breviatea harbour mutualistic Arcobacter epibionts. Nature.
6. Kleiner M, et al., 2017, Assessing species biomass contributions in microbial communities via metaproteomics. Nat Commun
7. Kleiner M, et al., 2018, Metaproteomics method to determine carbon sources and assimilation pathways of species in microbial communities. Proc Natl Acad Sci U S A.
8. Meier F, et al., 2018, Online parallel accumulation-serial fragmentation （PASEF） with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics.
9. Muth T, et al., 2018, MPA portable: a stand-alone software package for analyzing metaproteome samples on the go. Anal Chem.
10. Gurdeep Singh R,et al., 2019, Unipept 4.0: functional analysis of metaproteome data. J Proteome Res.
11. Heintz-Buschart A, et al., 2016, Integrated multi-omics of the human gut microbiome in a case study of familial type 1 diabetes. Nat Microbiol.
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