[连载4]胶质瘤疫苗免疫治疗和免疫病毒治疗 （脑胶质瘤基础与临床研究 ）

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本文摘自人民卫生出版社出版的《脑胶质瘤基础与临床研究》，作者刘福生、金贵善；《神外前沿》发布此文，已获出版社书面授权及作者本人许可。

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第三节 胶质瘤疫苗免疫治疗 

分子疫苗集中于将肿瘤细胞或相应的抗原肽制成疫苗. 诱发机体特异性的体液或细胞免疫. 进而通 过患者自身免疫系统杀灭肿瘤细胞. 国内外对分子疫苗的研究主要集中在致敏树突状细胞、 高免疫原性 胶质瘤细胞疫苗、 卡介苗等. 目前. 树突状细胞被认为是最具有应用前景的肿瘤疫苗. 

一、 胶质瘤疫苗治疗概述 

肿瘤疫苗治疗属于主动免疫治疗. 因为其依据患者自体的免疫系统来对胶质瘤进行治疗. 免疫治疗 的优势在于激发体内广泛的免疫反应. 但是基于肿瘤细胞的免疫提呈能力弱的特点. 针对于肿瘤细胞的 免疫疫苗较难生成. 对于肿瘤免疫而言. 关键的问题在于提高树突细胞 (DC) 对肿瘤抗原的免疫提呈 能力. 可以在体外分离出 DC 细胞. 并培养激活其免疫提呈能力. 肿瘤细胞本身、 肿瘤裂解物、 肿瘤蛋 白、 肿瘤蛋白肽段、 肿瘤 DNA 及 RNA 成分都可以激活 DC 细胞的免疫提呈能力. 

通过疫苗诱导激活胶质瘤患者的特异性免疫反应过程中. 自体的树突状细胞 (DCs) 是最常用到的 抗原提呈细胞 (APC). 树突状细胞 (DCs) 是最强大的自身适应性免疫的激活因子. 可以通过提呈抗 原激活自然杀伤细胞 (natural killer cell. NK) 以及自然杀伤细胞 T (NK T) 细胞. 通过白细胞分离的 方法从胶质瘤患者体内获得的外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell. PBMC) 来源的 DC 细 胞. 体外通过与肿瘤裂解产物或者膜表面的肽段反应的刺激活化. 或者是将肿瘤细胞与 DCs 细胞融合. 将以上肿瘤抗原活化的 DCs 细胞重新输入到患者体内 (大多数通过皮内注射的方式. 皮下和静脉注射 也有报道). 注射到体内的 DCs 细胞迁移到相应淋巴结附近以激活肿瘤抗原特异性的细胞毒性 T 淋巴细 胞 (CTLs). 诱导宿主持续的抗肿瘤反应并形成免疫记忆. 

胶质瘤疫苗在从实验室向临床的转化中已经取得了很大的进步. 胶质瘤 DC 疫苗在早期的临床研究 中表现良好. 肿瘤疫苗需要激活宿主的免疫反应. 免疫治疗的优点之一是副作用相对很少. 术后的 DC 免疫治疗的研究也正在进行中. 研究结果表明. 自体的疫苗治疗可以改善无进展生存期 (progression free survival. PFS) 和总生存期 (overall survival. OS). 并且复发胶质瘤患者术后的应用载有肿瘤裂解 产物的 DC 细胞刺激免疫反应治疗效果良好. 临床上改善患者的 PFS 依赖于完全手术切除. 患者的低龄 以及尽可能迅速的 DC 免疫治疗. 已经有很多特异性针对胶质瘤细胞的疫苗研究的报道. 对于胶质瘤特 异性抗原的研究使得胶质瘤特异性疫苗的开发成为可能. 比如说 EGFRvIII (epidermal growth factor re¯ ceptor variant 3). 研究证明 EGFRvIII蛋白片段的疫苗被证明是有效的. 可以改善患者 PFS 和 OS. 其他 的策略包括针对肿瘤裂解片段、 特异性针对肿瘤干细胞抗原或者是针对巨细胞病毒抗原 (cytomegalovir¯ us. CMV) 的疫苗等. 

二、 EGFRvIII疫苗 

表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor. EGFR) 在细胞迁移、 细胞分化以及细胞凋亡中 发挥重要作用. 在多种肿瘤中都存在异常 EGFR 信号. 但是. 正常的组织细胞中也表达 EGFR. 所以靶向 针对 EGFR 的治疗可能对正常的细胞有副作用. 而 EGFRv III在 24% ~ 67% 的 GBMs 中都有表达而在正常的 胶质瘤组织细胞中没有表达. EGFRv III的突变使得受体持续性活化并使得胶质瘤细胞增殖失控. 细胞恶性 度增加. 合成的 EGFRv III蛋白片段的疫苗在新诊断胶质瘤患者中正在开展临床I期和II期治疗. 

在临床I期颅内肿瘤的治疗中. 应用载有 EGFRvIII蛋白片段的 DC 细胞来制备疫苗. 患者对疫苗的 免疫反应低. 超过 60% 的患者对治疗有效. 在接受治疗的 12 名患者中. 中位无进展生存期 ( median progression¯ free survival) 为 10 2 个月. 中位总存活期 ( median overall survival) 为 22 8 个月. 后期的研 究发现患者生成了针对 EGFRvIII片段的抗体. 并且 T 细胞特异性升高. 患者的组织化学分析表明患者组 织中已不再表达 EGFRvIII. 在临床II期的治疗中. 19 例新诊断表达有 EGFRvIII的患者接受了疫苗以及 巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colony stimulating factor. GM¯CSF) 的治疗 (NCT00643097). 在此 研究中. 中位无进展生存期 (median progression¯ free survival) 为 12 个月. 而没有经过这一治疗的对照 组中位无进展生存期为 7 1 个月. 患者的中位总存活期 (median overall survival) 为 47 7 个月. 对照组 为 22 8 个月. 治疗后的患者的组织化学分析表明患者组织中已无 EGFRvIII表达. 在替莫唑胺联合 EG¯ FRvIII治疗的临床实验中. 同样证明治疗是有效的. 并且在此实验中. 疫苗的免疫强度被加强. 患者的 生存期由 15 2 个月提高到了 23 6 个月. 

EGFRvIII肽段疫苗已经进展到临床III期研究. 并联合 GM¯CSF 治疗 (NCT01480479). 目前此研究 正在进行当中 (EGFRvIII疫苗的研究进展见表6¯1). EGFRvIII疫苗研究表明胶质瘤单一肽段的安全性以 及有效性. 但 GBM 肿瘤存在广泛异质性. 这一特征必然会降低单一肽段疫苗对治疗的长期有效性. 

三、 胶质瘤裂解产物及特异性多肽片段疫苗 

应用完整的肿瘤裂解产物作为抗原可以提供全面的针对患者的特异性疫苗. 通过体外培养肿瘤细 胞. 并用表面组织相容性符合物分离出表面蛋白. 与自体 DCs 细胞结合. 在 2000 年. 这一方法的可行 性就已经得到验证. 在 2005 年的临床I期实验研究表明通过这一方法制备的疫苗并没有副作用. 但是 患者的生存率同时也没有得到很明显的改善 (NCT00068510). 患者在数周中轮番接受了三种不同的疫 苗治疗. 并且延续了 5 年. 患者的血液样品中显示存在针对肿瘤细胞活化的 T 细胞. 约一半的患者脑组 织中显示存在 T 细胞的浸润. 后期的研究表明若肿瘤细胞低表达 TGFβ2. 则 T 细胞浸润明显. 患者的生 存率也得到明显的改善. 提示 TGFβ2 可能是疫苗治疗有效性的一个标志. 

其他的研究成果也支持以上的结论. 基因分析表明依据基因表达的特征. 胶质瘤可以划分为三类: 原神经类. 过度增殖类以及间叶细胞类. 虽然有些研究表明原神经类的胶质瘤有较好的预后. 但近期临 床试验显示 DC 疫苗对间叶类胶质瘤的疗效最好. 患者的生存率得以明显改善. T 细胞对肿瘤组织的浸 润性也最好 (NCT00068510). 这些肿瘤裂解物疫苗在小儿 GBM 患者中也正在开展研究. 并且即将开展 一项相应的临床I期研究 (NCT01808820). 

针对肿瘤裂解物疫苗. 现今有许多的临床II期研究和一项临床III期研究在进行中. 在临床II期研究 中. 应用两种免疫佐剂辅助肿瘤裂解产物刺激 DCs 细胞的免疫反应. 分别是刺激细胞毒性 T 细胞反应的 免疫调节药瑞喹莫德 (Resiquimod). 以及通过赖氨酸和羧甲基纤维素 (carboxymethylcellulose. poly¯ ICLC) 整合稳定的细胞聚胞苷酸 ( polyinosinic¯ polycytidylic acid) . 后者可以增加 T 细胞对胶质瘤的浸润 能力 (NCT01204684). 正在进行的III期临床试验在进行放射性治疗以及替莫唑胺治疗的同时. 联合应 用以上的疫苗治疗. 观察治疗效果. 

肿瘤裂解物的研究提供了一系列抗肿瘤的免疫肽段. 而这些免疫肽段所产生的免疫疗效则依赖于它 们与人白细胞抗原 (human leukocyte antigen. HLA) 的结合以及进一步提呈给 DC 细胞的能力. 美国的 一项实验研究试图发现特异的肿瘤肽段可以结合 HLA. 并形成良好的免疫反应. 它们应用 11 种不同的 肿瘤相关肽段 (tumor associated peptides. TUMAPs) 激活免疫反应的能力. 初步的I期临床试验结果表 明接受疫苗的8名患者 (分别接受不同的免疫肽段疫苗) 有良好的免疫反应并且没有出现相应的不良反 应 (NCT01403285). 

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四、 肿瘤干细胞疫苗 

肿瘤干细胞 (cancer stem cell. CSCs) 是胶质瘤中的一个细胞亚群. 它们可以自我复制并且分化为 多种神经细胞. 在胶质瘤发生发展中起重要作用. 并对脑肿瘤的化疗和放疗有耐受性. 针对 CSCs 疫苗 的研究也备受推崇. CSCs 过表达很多的肿瘤相关抗原. 包括 HER2 / neu 以及 IL13Rα 2 等. 存在这些抗 原表达的患者往往治疗效果差. 预后不理想. 在动物模型中. 已经证明针对 CSCs 裂解产物的 DC 细胞 疫苗可以激活 T 细胞的免疫反应. 

胶质瘤肿瘤干细胞表面表达 CD133. 针对 CD133 的自体 DC 疫苗. 正在进行临床试验研究 (NCT02049489). 针对肿瘤单一肽段的疫苗不能够杀伤没有携此片段的异型肿瘤细胞. 而全肿瘤细胞来 源的多重肽段疫苗则包含全部的肿瘤相关抗原 (tumor¯associated antigens. TAAs). 可以杀伤各种类型的 肿瘤细胞. 应用范围广. 

ICT¯ 107 是一携带有 6 种合成的 CSCs 相关肽段的 DC 细胞疫苗. 所产生的抗体可以特异性地结合杀 伤肿瘤干细胞. 在一项临床I期研究中. 胶质瘤患者接受传统的胶质瘤治疗并联合 ICT¯107 治疗. 结果 显示患者的中位无进展生存期 (median progression¯free survival) 显著提高. 而总存活期 (overall surviv¯ al) 却没有变化. 在这项研究中共有 21 名患者参与了治疗的研究. 在 6 周中接受了 3 次疫苗注射治疗. 接受治疗的患者至少表达 ICT¯107 疫苗中所涉及的 3 种抗原. 75% 的患者表达疫苗中的所有 6 种抗原. 研究结果表明. 治疗后患者的中位无进展生存期 ( median progression¯ free survival) 为 16 9 个月. 患者 的中位总存活期 (median overall survival) 为 38 4 个月. 有趣的是. 治疗后再次接受手术的患者的肿瘤 组织分析显示. 治疗后组织中肿瘤干细胞组成比例比治疗前明显减少. 这表明 ICT¯107 确实能特异性杀 伤肿瘤干细胞. 而传统的治疗针对这些患者的疗效很差. ICT¯107 正在进行II期临床研究 (NCT01280552). ICT¯107 正在进行II期临床研究 (NCT01280552). 并且在中国也即将会开展一个针对 CSCs 相关肽段的 DC 细胞疫苗的临床II期实验 (NCT01567202). 

五、 巨细胞病毒疫苗 

许多病毒发生发展与肿瘤密切相关. 如人乳头状瘤病毒 (human papilloma virus) 与宫颈癌. EB 病 毒与淋巴瘤密切相关. 而人巨细胞病毒 (CMV) 是最常见的胎儿感 病毒. GBMs 患者体液中含有巨细 胞病毒 (CMV) 蛋白. 在胶质瘤易发动物模型中. 若感 鼠巨细胞病毒 (CMV). 可以极大地降低动物 生存率并增加 GBMs 在其中所占的比例. 巨细胞病毒 (CMV) RNA 疫苗正在进行初始的临床试验. 13 名患者在接受传统治疗的同时并进行疫苗的治疗. 患者的中位无进展生存期 (median progression¯free survival) 为 15 4 个月. 整体存活率为 20 6 个月. 另外一个针对于 CMV 疫苗的临床试验研究 “ PEP¯ CMV” 也即将开展。

六、 应用多重肽片段加强疫苗作用 

根据不同的疫苗策略所生成的疫苗的活性是不同的. 所诱导生成的 T 细胞反应强度也存在巨大的差 异. 而在这个免疫过程中. 诱导I型免疫反应尤其重要. 用 IL¯4 处理 DCs 细胞可以增强 IL¯12 的生成. 从而促进I型免疫反应. 现阶段. 应用 IL¯4 基因转导的成纤维细胞联合自体的胶质瘤细胞疫苗以及联 合应用自体胶质瘤细胞裂解物活化的 DCs 细胞疫苗临床试验正在进行当中. 

应用新的 DC 细胞的培养方法同样可以优化 DC 细胞的抗肿瘤免疫作用. 单核细胞在有 GM¯ CSF 和 IL¯4的环境下培养会生成不成熟的DCs细胞. 进一步应用IL¯1β、 TNF¯α、 IFN¯α、 IFN¯γ. 以及poly¯ I: C 对细胞进行极化. 以形成 α¯1 型极化的 DCs 细胞 (DC1). 这样可以增强 DC 细胞的迁移能力并增 强 IL¯12 因子的生成 (相应的疫苗总结见表 6¯1). 

综上. 我们可以从以上临床I期以及II期试验中得到一个共同点. 那就是所有的 GBM 肿瘤疫苗试 验都是安全的. 同时. 在临床研究中观察到. 在免疫治疗中. 大脑中存在活化的免疫 T 细胞. 并且肿瘤 组织中也有浸润的免疫细胞. 另外. 在 EGFRvIII疫苗治疗中. 之前肿瘤组织中表达 EGFRvIII的胶质瘤 患者在接受相应的疫苗治疗后. 后期复发并进行手术患者的病理结果显示肿瘤组织中已经不再有 EGFRv III蛋白的表达. 这也充分说明了疫苗免疫治疗是有效并可开发的. 

选择合适的免疫抗原以及免疫疫苗的策略在免疫治疗过程中尤其重要. 在所有的疫苗治疗的临床试 验中. 没有一项可以完全治愈肿瘤. 所以有必要进一步改进已有的疫苗靶点. 另外. 肿瘤的微环境会抑 制疫苗免疫反应. 这也限制了疫苗的治疗效果. 现在的治疗策略集中在加强抗肿瘤的免疫反应上. 如果 再选择行之有效的免疫疫苗. 抑制免疫微环境以对抗免疫反应的负面作用. 疫苗免疫治疗的效果可能会 更上一个台阶. 相信未来这一项目会得到很好的发展. 

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第四节 胶质瘤免疫病毒治疗 

应用溶瘤病毒治疗肿瘤在近期有了明显的改进和发展. 溶瘤病毒可以感 肿瘤细胞并在其中复制扩 

增.裂解细胞后进一步感 杀伤其他的细胞. 基因修饰的溶瘤病毒在以上作用的前提下.表达杀伤基因 进一步杀伤肿瘤细胞. 免疫病毒治疗将免疫调节基因插入到溶瘤病毒中.利用免疫机制杀伤肿瘤细胞.进一步利用免疫反应诱导肿瘤死亡. 现今已有将 GM¯ CSF 基因插入到溶瘤病毒中进行治疗的报道.此溶 瘤病毒表达 GM¯ CSF 蛋白.这一类型溶瘤病毒已经在临床III期的研究中显示有效. 

近年的研究发现脑胶质瘤干细胞 (GSCs) 是胶质瘤复发的根源.该类细胞具有高度的自我更新能 力以及分化成高活性增殖肿瘤细胞的能力. 而且该细胞对化疗、 放疗具有耐受性.其表面高度表达干细 胞表面标志物 CD133. 该类干细胞对化疗及放疗存在耐药性. 所以针对 GSCs 杀伤的溶瘤病毒具有很好 的临床应用前景. 研究表明.溶瘤病毒在去除 ICP47 基因后.可以有效感 并裂解杀伤胶质瘤干细胞. 著者所在实验室也正在进行针对杀伤 GSCs 的溶瘤病毒的研究. 

有研究者将免疫因子如 IL¯12 插入到溶瘤病毒中.并同时去除 ICP47 基因.其中的溶瘤病毒在杀伤 胶质瘤细胞.尤其是胶质瘤干细胞的同时.分泌生成 IL¯12. IL¯12 在治疗中发挥以下多重免疫作用: 1抑制 VEGF 因子的生成.从而抑制肿瘤血管生成2促进趋化因子配体 10 (CXCL10) 的分泌.抑制 血管的生成以及干扰素 γ ( IFNγ) 的分泌.从而促进 TH1 型免疫反应，3促进胶质瘤细胞中调节性 T 细胞的积累.从而促进 T 细胞调节的免疫反应. 初步实验表明 G47Δ¯ IL12 溶瘤病毒的治疗效果良好.进 一步的实验仍在进行当中.

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第五节 胶质瘤有效免疫治疗方法的挑战 

尽管在前期临床研究中.胶质瘤主动免疫治疗效果良好.但是在胶质瘤免疫治疗实际应用中.治疗 的免疫微环境以及血脑屏障等其他因素限制了胶质瘤免疫治疗的发展. 胶质瘤细胞是弱的抗原提呈细 胞.其原因有两个方面。一方面.胶质瘤细胞表面蛋白存在磷酸化不完全以及细胞骨架的重排不完整的 问题. 而以上这些是抗原提呈细胞 (APCs) 与 T 细胞接触并激活免疫反应的必需条件. 研究实验也表 明.从胶质瘤患者中提取的 T 细胞在体外如果与 APCs 细胞的接触不充分.就不能被很好地激活从而诱 发免疫反应. 另一方面.肿瘤细胞会直接或间接通过肿瘤微环境来控制宿主对肿瘤细胞的免疫反应. 在 肿瘤微环境中的免疫细胞以及它们对于肿瘤的杀伤能力很大程度上依赖于相应的肿瘤浸润性淋巴细胞 (Tumor infiltrating lymphocyte.TIL) 亚基. 大多数的 CD4 + T 细胞会影响到肿瘤的发生发展.CD8 + T 细 胞具有抑制肿瘤细胞的作用.而调节性 T 细胞具有抑制肿瘤抗原的作用. 肿瘤刺激产生的细胞因子会相 应增强辅助性 T 细胞的作用.但同时会降低调节性 T 细胞的功能.从而降低自然肿瘤免疫. 通过肿瘤微 环境分泌的肿瘤抑制因子.如 TGFβ 可以发挥抑制免疫系统的作用.从而促进肿瘤细胞增殖侵袭. 

通过肿瘤抗原提呈的 DC 细胞诱导体内产生肿瘤特异性 T 细胞的效果往往不太理想.因为肿瘤特异 性 T 细胞的提呈效率低.并且 TAAs 免疫原性相对较弱. 下调细胞表面的 MHC 分子会限制肿瘤疫苗的 有效性. 而低效率的免疫反应可以通过增强免疫细胞反应强度或者是增强宿主的免疫反应强度来实现.前者如增强 T 细胞的胞内信号区域的表达强度.后者如应用免疫刺激因子等. 

除了不同患者之间存在不同的抗原表达之外.相同胶质瘤患者的不同胶质瘤细胞表面蛋白也存在很 大的差异.并且会随着病情的进展而发生突变. 由于以上的原因.肿瘤的靶向治疗会随着时间的延长而 出现耐药. 而预防这一耐药现象的措施是同时靶向抑制多种 TAAs.比如应用全肿瘤细胞来源的 DC 疫 苗. 而血脑屏障 (blood brain barrier.BBB) 的存在限制了在胶质瘤治疗过程中系统的免疫反应强度.并且有人认为脑部区域是免疫赦免区. 在这种情况下.许多研究都采用了直接将免疫细胞注射到肿瘤部 位的方法来避开血脑屏障. 但是在胶质瘤免疫疫苗的应用过程中.可以看到脑部有胶质瘤免疫细胞的存 在. 说明胶质瘤的免疫治疗存在应用开发的前景.并需要采取具体的措施提高细胞的免疫反应或增强宿 主本身的免疫应答. 

总之.因为肿瘤异质性的存在以及肿瘤细胞分泌的因子所形成的有利于肿瘤细胞免疫逃逸的宿主环 境.胶质瘤细胞的免疫治疗存在很多的挑战. 虽然存在很多的问题.在过去的十年中.胶质瘤的免疫治 疗依然取得了很大的成就. 早期的临床试验证明胶质瘤的免疫治疗是有效且安全的.接下来我们研究工 作的任务是要建立起胶质瘤免疫治疗的标准方法. 

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