解开“儿童肿瘤之王”的秘密

孩子是每一个家庭希望和幸福的所在。初为父母都希望自己的孩子能健康快乐的成长，但是却有这么一种疾病，它专门攻击父母心爱的孩子，且治愈率极低。它就是——神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是源于周围神经系统前体细胞的儿童期固体恶性肿瘤。

96%的患者于10岁前发病，恶性程度高、进展快、容易早期转移到骨髓、骨及肺、脑等其他脏器，而常规治疗方法的5年生存率仅为10-20%。长期以来，神经母细胞瘤治疗效果差，预后不佳，几乎占全部儿童癌症死亡的15%。因此，神经母细胞瘤又被称为“儿童肿瘤之王”。

在2015年，德国科隆大学与华大基因一起，综合运用了全基因组测序、目标区域测序、RNA-seq、ChIP-seq、FISH等多项技术手段，在《Nature》杂志上发表了一篇文章，初步诠释了高风险NB的发生机制。

▲请参考科技君前期解读：对于"儿童肿瘤之王"，我们做了这些...

近日，华大基因又联合日本千叶癌症中心研究所等团队，进一步探讨了NB的机理，而这次主要针对的是较低风险和中风险的NB。样品中有2对非常稀少的同卵双胞胎患者样本，这两对样本有着非常独特的进化通路。之前的临床分析推断这两对双胞胎样本是胎内转移，通过基因组分析进一步证明了这个结论，是本文的一大亮点。

研究概述

NB是源于周围神经系统前体细胞的儿童期实体恶性肿瘤。本研究者团队先前已经建立了一个基于DNA拷贝数分布的风险分类系统。为了进一步探索不同风险组NBs的发病机制，找到导致肿瘤发生的新的体细胞基因突变， 研究者对57个原发性和7例复发/转移性肿瘤的全外显子测序分析，通过基因组亚组系统分类确定了独特的染色体畸变谱。 

总体来说，发现体细胞突变的频率很低，除了6个肿瘤患者中检测到几个参与轴突引导通路的基因ALK ， SEMA6C ， SLIT1和NRAS的突变。一些突变基因富集在轴突指导通路（12个基因）、MAPK通路（25个基因）、Wnt通路（13个基因）上。基因组分析显示双胞胎以及散发患者的原发和对应复发或转移的肿瘤是同一克隆起源并呈现不同程度的异质性。同卵双胞胎NBs显示出不同的进化轨迹。这些结果表明以上三个通路参与NB的发生发展，且不同分级的NB呈现基因组多样性。

研究内容

在本研究中，重点关注两个主要亚组Ss(S型且无MYCN扩增, 预后较好)和P1a(1p缺失，17q扩增和MYCN扩增，预后较差)，对其进行全外显子测序（WES）分析，在基因组层面寻找可能存在的差异。本研究一共使用了57例NB患者的肿瘤原发样本和7例患者的复发/转移样本，其中51个为散发样品，另外一些样品有家族遗传史。

 一、研究肿瘤分型及临床相关特征

手段：利用array CGH分析建立一个NB分型系统

结果：NB主要可以分成3大类：基因组稳定型(S)，基因组部分扩增缺失型(P)和全基因组扩增缺失型(W)。本文中主要研究Ss和P1a这两个亚型，结果显示两者的预后有显著差异，其中P1a型病人的5年生存率更低。

图1 Ss和P1a小亚型的基因组图谱以及和预后的关联性

 二、全外显子点突变分析

手段：利用muTect软件分析WES数据得到体细胞突变（somatic mutation）结果

结果：（1）从64例样本中总共发现1685个体细胞突变，这些突变主要集中在C-T类型。另外，突变频率与MYCN扩增显著相关。突变数量在Ss和P1a两个亚型之间也有显著差异，P1a型病人会发生更多的体细胞突变。

图2 神经母细胞瘤的突变特征

（2） 对得到的体细胞突变数据做pathway关联分析发现：NB与3个通路有关：Axon guidance通路, Wnt信号通路和 MAPK信号通路。

图3 和NB有关的三个信号通路图

 三、肿瘤异质性与进化通路分析

手段： 利用ABSOLUTE软件估算每个点突变和CNV的cancer-cell fraction(CCF), 进而研究每个样本的异质性和构建进化通路。

分析结果：（1）NB15和NB37都有对应的复发样本：NB15的原发和复发样本有相同的CNV变化，1q缺失，2q和17q扩增，另外NB15的复发样本在MGA基因上发生了特有的点突变。NB37的复发样本点突变很少，可能是因为纯度太低的影响。

图4 肿瘤成对样品的进化树（不同时间）

NB49分别取了不同部位的原发样本，这两个样本的相似度很高，他们的CNV变化非常相似，说明在这个病人癌症发生早期有剧烈的基因组变化。但是这两个样本的点突变还是有差异，说明不同部位肿瘤之间的进化差异。

图5 肿瘤原发样品的进化树（不同部位）

NB53有对应的转移样本，他的转移样本发生了大量的点突变，这说明在转移过程中发生了剧烈的进化过程。

图6 肿瘤原发和转移样品的进化树

（2）在样本中有2对非常稀少的双胞胎样本，这两对双胞胎样本有着非常独特的进化通路。之前的临床分析推断这两对双胞胎样本是胎内转移，通过基因组分析进一步证明了这个结论。双胞胎1的两个病人之间有共有的突变发生在SP4和ZNF304基因上，这两个病人之间可能是发生了早期转移，然后在不同外界环境影响下，导致基因组之间的巨大差异。双胞胎2的两个病人之间不仅有共有的点突变在SEMA6C和PCDHGA4基因上，且他们的基因组非常相似，所以研究人员猜测可能是发生了晚期转移。

图7 同卵双胞胎神经母细胞瘤的进化轨迹

讨论

体细胞突变指肿瘤组织DNA中特有的突变，已经排除了此病人的胚系突变的影响，为肿瘤DNA中特有，这些突变的准确鉴定是肿瘤基因组分析研究的基础。而DNA层面的拷贝数变异越来越成为研究热点，不仅是拷贝数的变异对基因后续的功能表现影响重大，而且它的研究为后续的肿瘤纯度分析以及克隆进化分析提供重要的线索。我们来回顾一下文章的研究思路：

（1）先利用array CGH分析建立一个NB分型系统，将其中的2个子亚类型分出来进行分析；

（2）使用体细胞SNV分析软件找到突变基因，并分析了其突变特征，做了体细胞突变数据和通路的关联分析；

（3）采用ABSOLUTE工具，利用样本的拷贝数以及变异数据的VAF来评估肿瘤细胞的纯度以及亚克隆情况，然后构建进化树。

以上可谓是思路清晰明了，难的是除了找到原发匹配的转移/复发的样本，还有2对稀少的同卵双胞胎样品，这对NB肿瘤进化研究提供了新的思路，值得大家借鉴，另外也提示大家肿瘤样品的纯度需要尽可能高一些，这对找到突变特别是低频突变的帮助特别大。

【参考文献】

[1] Yuanyuan Li, Miki Ohira, Yong Zhou, et al. Genomic analysis–integrated whole-exome sequencing of neuroblastomas identifies genetic mutations in axon guidance pathway[J]. Oncotarget.2017

撰稿：雷一鸣

编辑：市场部

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