美国FDA告诉你：RNA-Seq完胜表达谱芯片！

原创 2017-05-23 赵青华大科技BGITech

对于生物基因表达的相关研究，基于芯片的Microarry和基于测序的RNA-Seq是近十几年来最热的技术。基因表达定量对于科研的重要性不言自明，特别是在精准医疗火热的大背景下，监管决策需要严格的评估，且各利益相关者之间需要达成共识。

在此背景下，去年，由美国FDA（ Food and Drug Administration美国食品药品监督管理局）领导的测序质量控制联盟（SEQC）发表了一篇综述文章^[1]，综合评估了RNA-Seq的技术表现。此文主要通过5个相互独立但在内容上又互补的SEQC项目（图1），分别评估了检测基因的数量、准确性、低丰度基因的准确性、可重现性和信息含量、不同技术间的兼容性等指标。（详见发现1~6）

总的来说，RNA测序优势更大，更广的检测范围、低表达基因有更高的敏感性，在可变剪切和基因融合检测更具优势。

图1 SEQC项目整体研究设计

A、基于标准样品的核心定量研究。在3个测序平台和11个实验室评估RNA测序的准确性、

可重现性和信息含量。华大基因作为主要参与机构。

B、500个神经母细胞瘤预后研究^[2]。华大基因作为主要参与机构，发现1、2和3。

C、27种化学处理超过100只大鼠肝脏的毒理研究^[3]，发现4和5。

D、利用RNA-Seq构建最完整大鼠表达谱。

E、芯片与RNA测序数据是否可以通用？^[4]，发现6。

F、更多研究

发现1

检测基因数量：RNA-Seq是芯片的2倍以上^[2]（图1B）

RNA测序鉴定出超过48,000个基因，而芯片不到一半，仅约21,000个。RNA测序中，4.52%的reads为新发现的外显子和Junction。注释出48,415个基因、204,352个转录本和319,231个外显子和Junction（图2）。

图2 RNA测序注释结果

（a reads比对比例、b 注释出的基因、转录本和Junction）

发现2

检测差异表达基因数量：RNA-Seq是芯片的2倍左右^[2]

RNA测序检测出21,315个差异表达基因，而芯片仅有测序的一半，11,688个（图3）。RNA测序独特检测出的差异表达基因高达11,715个，而芯片仅有测序的18%，2,088个。

图3 RNA测序和芯片差异表达基因鉴定数

发现3

转录本变异体差异表达检测数量，RNA-Seq是芯片的8倍^[2]

一个基因有多种转录本变异体，表达情况有时就比较复杂，有两种情况，（1）一个变异体差异表达，而另一个没有差异表达；（2）一个变异体上调，另一个下调。结果发现RNA测序在检测复杂转录本上比芯片更具优势。在RNA测序检测出的21,315个差异表达基因中，65.9%是情况1。这其中包含一些癌症基因，比如NF1和MDM4（图4）。RNA测序能鉴定出1,073个情况2的差异表达基因，而芯片只有129个（图5）。

图4 MDM4基因的转录变异体差异表达

（A S型转录本在ST4上调，B S型和FL型比值在ST4比值增高）

图5 癌症基因不同转录本差异表达检测的RNA测序和芯片比较

（A 根据注释情况、结构复杂性和蛋白编码能力分类，B 复杂调控的差异表达基因维恩图）

发现4

低丰度基因检测准确性，

RNA-Seq的qPCR验证率是芯片的5倍^[3]（图1C）

RNA测序在低丰度转录本检测上有更高的精确度。RNA测序比芯片在差异表达基因qPCR验证率上更优，93%比75%。分成高表达和低表达来看，两个平台在高表达的差异表达基因上与qPCR的一致性都很高，不过RNA-Seq更高一些，94%，芯片88%。但测序在低表达的基因qPCR验证率上远胜芯片，89%，而芯片仅有17%（图6）。

图6 不同丰度的差异表达基因， qPCR验证率的RNA测序和芯片比较

发现5

差异表达倍数准确性，RNA-Seq与qPCR相关性比芯片高14%^[3]（图1C）

差异表达倍数变化的响应上，RNA测序与qPCR相关性更好，R²=0.97，芯片相关性R²=0.85，高14%。在回归斜率上，RNA测序接近1，但芯片偏离1，向x轴倾斜（图7）。

图7 差异表达基因差异倍数与qPCR相关性的RNA测序和芯片比较

发现6

芯片与RNA测序数据是否可以通用？^[4]（图1E）

同样来自于SEQC/MAQC Consortium研究，标题为“An investigation of biomarkers derived from legacy microarray data for their utility in the RNA-seq era”（在RNA-seq时代，遗留的芯片数据产生的biomarker可用性调查）。

标题中毫不客气地指明这是RNA测序时代。测序取代芯片是必然的，然而在生物医学研究领域遗留了芯片提供的大量数据、预测模型和biomarker，这些是否可以直接用于RNA测序数据？文章利用两个大的临床数据集，498个神经母细胞瘤样品和175个急性骨髓性白血病样品，证实芯片和RNA测序数据biomarker研究是可以相互转移的（图8）。在即将到来的RNA测序时代，遗留下来的大量芯片数据持续可用于RNA测序数据。

图8 跨平台可转移性评估流程图

测序时代，您还在用表达谱芯片吗？

引用文献4标题来说，这是一个“RNA-seq era”（RNA测序时代）。

与基因芯片技术相比，RNA-Seq技术无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录本进行检测；能够提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围。

过去测序价格昂贵，而近年来随着测序成本骤减，且数据质量和速度大大提升。再加上您以前做过的芯片数据可用于测序数据分析中，现在正是您做测序最好的时机。

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参考文献

[1] Xu J, Gong B, Wu L, et al. Comprehensive Assessments of RNA-seq by the SEQC Consortium: FDA-Led Efforts Advance Precision Medicine. Pharmaceutics. 2016 Mar 15;8(1). pii: E8.

[2] Zhang W, Yu Y, Hertwig F, et al. Comparison of RNA-seq and microarray-based models for clinical endpoint prediction. Genome Biology. 2015 Jun 25;16:133.

[3] Wang C, Gong B, Bushel PR, et al. The concordance between RNA-seq and microarray data depends on chemical treatment and transcript abundance. Nature Biotechnology. 2014 Sep;32(9):926-32.

[4] Su Z, Fang H, Hong H, et al. An investigation of biomarkers derived from legacy microarray data for their utility in the RNA-seq era. Genome Biology. 2014 Dec 3;15(12):523.