解密∣如何做到仅测4个RNA-Seq，就发3分以上文章？

导读

近年来高通量测序价格骤降，各大期刊对文章的测序数据要求不断提高，所以大规模样品、多次生物学重复已然成为主流趋势。可是就有这么一篇今年4月刚发表的文章，仅仅用4个样品BGISEQ-500 RNA-Seq，就在世界上唯一高品质水稻期刊《Rice》（影响因子：3.417）上发表，究竟是怎么做到的？今天科技君就给大家深扒解密一番

✪文章标题：过表达OsHSP18.0-CI提高水稻对细菌性条斑病的抗性

✪发表期刊：Rice

✪影响因子：3.417

✪发表时间： 2017年4月17日

✪单位：山东农业大学等

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概述

✪背景：小热激蛋白是一个蛋白大家族，响应各种非生物与生物胁迫。水稻中的小热激蛋白基因OsHSP18.0-CI有报道发现响应盐和镉等非生物胁迫，但对抗病原菌的直接功能并不清楚。

✪结果：本文发现OsHSP18.0-CI 能被水稻病原细菌性条斑病菌诱导表达，超量表达能显著增强水稻对条斑病菌RS105的抗性，抑制表达则能显著提高敏感性。

为了探究该基因提高抗性的作用机理，研究人员对接种条斑病菌RS105前后的野生型材料WT和过表达的转基因材料OE进行了RNA-Seq，对所有表达基因进行分析。

差异基因的GO分析结果显示，OE接种后的差异表达基因与WT表现出类似的GO分类结果，但OE中富集到每个Go term的基因数量都明显高于WT。OE和WT的共同差异基因主要富集在与免疫反应相关的PR基因、水杨酸Sa、茉莉酸JA合成相关基因等，并且这些基因在OE中表现出更显著的差异表达。

这些结果说明OsHsp18.0-CI是通过增强水稻的基础防卫反应，提高水稻对条斑病的抗性的。了解完文章的大致信息，接下来就是敲黑板划重点的时候了，请跟着科技君的脚步来看看这一篇文章的奥秘吧！

解密开始

✪研究目的：单一明确，针对一个基因与一种抗病性的关系。

✪研究方法：简单实用，如克隆基因、构建载体、转基因、表型观察、PCR、qRT-PCR、RNA-Seq等。而文章中应用的BGISEQ-500 RNA-Seq，clean reads比率99.98%，挑选基因全部通过qRT-PCR验证，在所有样品中倍数变化趋势一致。

✪设计思路：首先构建好转基因材料，在当代和后代中通过表型观察和qRT-PCR方法确定了OsHsp18.0-CI抗病作用。但是深入的作用机制还不明确，该基因是否也改变了其他基因表达水平。因而通过RNA-Seq对整体上所有表达基因进行分析，并验证。最后通过表型观察来评估过表达对生长发育影响。

图1 实验设计

✪研究结果：新颖鲜明， OsHSP18.0-CI对抗水稻细菌性条斑病的功能机制首次报道，结论明确。

我们再来详细看一下文章的主要结果：

>>>>1、OsHSP18.0-CI与水稻病原细菌性条斑病抗性关系

OsHSP18.0-CI能被水稻病原细菌性条斑病菌诱导表达。过表达提高水稻对条斑病菌RS105的抗性，抑制表达则提高敏感性，而且对多个条斑病菌株如HGA4、HGA2等都具有抗性。

图2 转基因植株后代的抗性情况

 a和b 叶片损害长度的观察图和测量图，c 叶片中细菌含量野生型WT，

超量表达OsHSP18.0-CI的转基因材料CD39R-7和 CD39R-11，

抑制表达转基因材料CD40R-9 和CD40R-12

>>>>2、BGISEQ-500 RNA-Seq鉴定过表达转基因材料和野生型材料的差异表达基因

对接种条斑病菌RS105前后的野生型材料WT和过表达OsHSP18.0-CI的转基因材料OE进行了RNA-Seq分析。4个样品，每个样品平均24M reads，基因组比对率87%，28,872个基因。raw reads是24M，clean/raw reads比率极高99.98%，所以过滤后还是24M，BGISEQ-500 RNA-Seq测序质量极高！

表1 RNA-Seq数据统计

在病菌RS105刺激下，野生型材料和过表达材料分别产生了898个和1844个上调表达基因， 738个共同差异基因（a）。这738个基因GO分析发现，差异表达基因在34个不同功能类别中的分布是相似的。

同样的，在病菌接种后，野生型材料和过表达材料分别产生了128和154个下调表达基因，29个共同差异基因，在野生型和过表达材料中都被抑制表达（b）。

相比于野生型，738个共同上调表达基因中，RS105诱导694个基因在过表达材料中表达更高（c）。29个共同下调表达基因中，16个基因在过表达材料中被RS105抑制更强烈（c）。

总之，接种后，大多数共同的差异表达基因，在接种后过表达材料中，变化更强烈。这个结果说明OsHsp18.0-CI是通过增强水稻的基础防卫反应提高水稻对条斑病的抗性。

图3 RNA-Seq研究基因表达谱

a 过表达vs野生型，野生型接种vs未接种，过表达接种vs未接种的上调基因统计，

b下调统计，c差异表达基因层次聚类

>>>>3、BGISEQ-500 RNA-Seq，水稻细菌性条斑病菌抗性有关基因的差异表达分析

发病机理相关基因的诱导表达和水杨酸茉莉酸含量提高，对提高水稻细菌性条斑病菌抗性十分重要。在738个和29个共同的上调和下调基因中，鉴定出28个基因，包含13个发病机理相关基因PR和8个水杨酸Sa生物合成、7个茉莉酸JA生物合成有关基因（a）。这些基因都是在接种后过表达材料，表达水平更高（a）。与基因表达一致，水杨酸和茉莉酸的含量在过表达材料中也提高了（c和d）。此外也发现一些乙烯或植物生长激素信号通路差异表达基因。

10个RNA-Seq上调表达基因全部通过qRT-PCR验证。10个基因在4个样品中基因表达的倍数变化趋势一致，即接种病菌后刺激了过表达和野生型表达量上调，而且过表达材料比野生型表达高（b）。qRT-PCR验证BGISEQ-500 RNA-Seq定量准确性很高！

图4 发病机理相关基因和水杨酸茉莉酸生物合成相关基因的表达。

a RNA-Seq层次聚类分析，b qPT-PCR验证RNA-Seq，c 水杨酸含量，d 茉莉酸含量

>>>>4、过表达OsHSP18.0-CI 基因对植株生长影响

结果发现负面影响极小。

朋友们，以上都get到了吗？总结起来，本文在下面这些方面都做到了精准！

（1）目的：单一明确，直击一个基因与一种抗病性功能机制问题。而这个基因在别的逆境中有报道，正好是一个研究其它逆境的材料。不得不说，这是一个很讨巧的方式。

（2）材料：丰富全面，不同表达水平材料，包含当代和后代。

（3）方法：本文的方法基本上都是属于简单实用型，如PCR、qRT-PCR、RNA-Seq等。而方法的重要性在于准确度。本文应用的BGISEQ-500 RNA-Seq，clean reads比率99.98%，挑选基因全部通过qRT-PCR验证，在所有样品中倍数变化趋势一致。这样极高的测序质量和定量准确性，为研究发现奠定了良好基础。

（4）设计：多角度，从表型和定量互相印证；既有目的基因的直接研究，也有所有表达基因的深入研究；验证和评估工作使得整个设计非常完整；

（5）结论：新颖鲜明， OsHSP18.0-CI对抗水稻细菌性条斑病的功能机制首次报道，结论明确。

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撰稿：赵    青

编辑：市场部

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