奇葩真菌如何从660种潜在寄主中找到“真爱”？

Original: 张义华大科技BGITech 2019-05-10

660种潜在寄主？没错，这个奇葩真菌就是大丽轮枝菌！大丽轮枝菌Verticillium dahliae是一种广泛危害农作物的半知菌亚门轮枝菌属真菌，寄主多达660种，已成为一个世界性难题。虽然寄主范围广泛，V.dahliae不同菌株各有所爱（有各自特异的原始寄主），一般来说，大丽轮枝菌对原始寄主的适应性和毒力最高，对其他物种适应性和毒力相对较弱；如V.dahliae Vd991以棉花为原始寄主，而V.dahliae JR2和V.dahliae VdLs.17原始寄主分别是番茄和莴苣。

同一菌种为什么会有这么大的寄主差异？不同的V.dahliae是怎么从660种潜在寄主中找到自己的真爱的？今年10月份，中国农业科学院、美国加州大学戴维斯分校和华大基因合作在New Phytologist发表了一篇文章以棉花枯萎病菌V.dahliae Vd991为主要研究对象来解答这些问题。

文献题目：Comparative genomics reveals cotton-specific virulence factors in flexible genomic regions in Verticillium dahliae and evidence of horizontal gene transfer from Fusarium

发表期刊：New Phytologist

发表时间：2017年10月30日

影响因子：7.21

发表单位：中国农业科学院、美国加州大学戴维斯分校、华大基因

文章概述

本文的主角V.dahliae Vd991以棉花为原始寄主，它的两个姐妹菌株V.dahliae JR2和V.dahliae VdLs.17原始寄主分别是番茄和莴苣。一般来说，大丽轮枝菌对原始寄主的适应性和毒力最高，对其他物种适应性和毒力相对较弱。不同菌株对宿主的适应性及毒力差异主要受染色体重组和种系特异性（lineage-specific, LS）基因区域影响。通过真菌de novo测序和比较基因组分析，发现V.dahliae Vd991的可变基因区存在棉花特异性的毒力因子，而一些棉花毒力相关基因很可能是从镰刀菌属（Fusarium）水平基因转移获得的。对目标菌株进行基因改造并进行毒力检测，结果发现，Vd991对棉花的毒力与其特有的7个G-LSR2基因密切相关。

主要结果

LS基因可能是适应性和致病性差异产生的原因

通过真菌de novo测序，得到高质量的V.dahliae Vd991基因组（genome size 34.8Mb, scaffold N50 951.7Kb），其中有33.9 Mb (> 97% genome size)区域与V.dahliae JR2和V.dahliae VdLs.17基因组具有高度共线性。然而，大量的LS基因的存在导致V.dahliae不同菌株基因组分差异很大。V.dahliae Vd991基因组中许多LS基因主要富集在几个狭窄的LSR（LS regions）。基因功能分析发现，LSRs很可能跟真菌的致病性相关，另外由于这些区域附近有转座子区域，导致该区域变异性较高，进化速度较快。

图1 三株大丽轮枝菌的共有和特有基因

图2 三株大丽轮枝菌共线性分析；各菌株均有特异性的LSR区

Vd991的某些特异性基因区可能是从棉花枯萎病菌Fusarium基因水平转移获得的

比较基因组研究发现，Vd991基因组某些LS基因（64个）与其他真菌属的物种基因相似性更高；其中32个基因与Fusarium spp.基因组同源。进一步研究发现，有7个G-LSR2基因特异性存在于Vd991基因组（在JR2或VdLs.17中没有这些基因），与F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度相似。F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433是一种土壤真菌，寄生于植物维管系统，可以引起棉花镰刀枯萎病。推测Vd991可能是在与F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433共感染棉花维管系统的过程中，获取了对应的LS基因或G-LSR2区域。

图3 Verticillium dahliae 的LS基因和镰刀菌属基因同源性分析；Vd991的7个G-LSR2基因与F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度同源

7个Vd991菌株特异性G-LSR2基因与V.dahliae在棉花中的毒力高度相关

为了确认G-LSR2对Vd991在棉花中的毒力的影响；通过基因敲除，得到两株与F. oxysporum f. sp.vasinfectum NRRL 25433高度同源的7个LS基因缺失的Vd991突变株，并验证它们的毒力；结果发现，两个突变株对棉花的毒力显著下降；而对番茄和莴苣的毒力并未受到影响。另一方面，将 Vd991特有的7个LS基因分别转入JR2或VdLs.17基因组，发现其中三个基因可以增加真菌对棉花的毒力；而不影响其本身对番茄或莴苣的毒力。该生物实验进一步验证了G-LSR2在Vd991对棉花适应性的重要作用。

图4 Vd991 G-LSR2区毒力因子鉴定。敲除G-LSR2区的7个LS基因，Vd991对棉花的毒力显著降低，对番茄和莴苣的毒力不受影响

图5 将 Vd991特有的7个LS基因分别转入JR2或VdLs.17基因组，VdLs.17 和 JR2对棉花的毒力和适应性均增加

主要方法

Vd991真菌de novo测序及相关分析

测序策略：三代测序（PacBio RSII）+ Miseq PE250+10Kb mate-paired文库测序

组装策略：三代测序+Miseq PE250组装得到contig, 10Kb mate-paired文库测序结果进一步延长scaffold，Miseq PE250测序结果进行纠错

基因组分分析：基因预测、重复序列、非编码RNA

基因功能注释：nr, eggNOGs，INTERPROSCAN (incorporating InterPro, GO and KEGG pathway annotation)

毒力因子预测：CAZy、PHI、蛋白激酶（PKs）分析

比较基因组分析：基因重排分析及PCR验证、基因家族分析、进化分析

三株V.dahliae真菌RNA-seq测序及相关分析

建库：TruSeqTM RNA Sample Preparation Kit