经典！Small RNA这3条发文思路，很好上手！

课程回顾

华大科技一年一度的春季培训开启全新模式 ——1小时线上课堂，专注解惑，在线回复，更接受量身定制，让老师们疫情防控、课题研究两不误！2月28日晚，华大科技资深技术支持经理李玉杰老师带来《从数据到文章——Small RNA测序数据解析》，以下是课程精华，供大家参考。

课程回顾

Small RNA是一类非编码RNA分子，长度在18到30个核苷酸左右。现有的研究表明，Small RNA广泛参与了一系列重要的生物学过程，是一类非常重要的非编码RNA分子。目前研究比较多的主要是三类，包括siRNA、miRNA以及piRNA。

测序技术发展起来以后，越来越多的研究采用高通量测序技术分析Small RNA在体内或细胞内的差异表达和对靶基因的调控作用。课程通过3个不同背景的研究案例，阐述Small RNA测序数据的实际应用。

第一个文章案例单独采用Small RNA测序数据进行卵巢癌外泌体miRNA的研究。miRNA在肿瘤的发生中具有重要的调控，可以在一些肿瘤中检测到miRNA的异常表达。而血浆外泌体中的miRNA受到保护以后，不容易发生降解。因此，血浆外泌体中的miRNA就有可能作为肿瘤诊断的biomarker。

差异表达的miRNA众多，如何筛选候选miRNA进行后续研究呢？该文提供了两条可供借鉴的思路：1）筛选跟本研究相关的已知miRNA；2）根据miRNA靶基因功能富集分析的结果筛选。

第二个案例，CVB3病毒侵染细胞系后miRNA的调控研究。本案例相较于上一个案例，增加的一个分析点是调控网络的研究。通过对miRNA靶基因调控的分层展示，揭示了病毒侵染细胞系以后可能的miRNA调控网络。

第三个案例是病毒感染动物的miRNA研究。在研究中，miRNA测序数据与mRNA测序数据联合分析，采用了3种不同的分析思路，揭示了雏鸭在受到病毒感染以后，体内免疫相关的通路激活，而miRNA可能在其中发挥了复杂的调控作用。本文可为病毒感染动物体的研究提供一定的思路借鉴。

课程最后一部分是Small RNA测序数据的分析和挖掘，通过实际操作，重新呈现文中部分重要的分析结果。现场学员表示，Dr.Tom系统不仅功能丰富，而且操作界面非常友好。这样一来，即使没有生物信息的分析背景，也能轻松实现测序数据的高效挖掘，再也不用担心数据下机以后的分析问题了。

课程答疑

1. 应当如何进行miRNA的PCR实验验证呢，为什么有些PCR验证的结果跟高通量测序结果不一致？

miRNA的序列较短，在设计引物的时候可以参考茎环法。由于miRNA长度非常短而且不同miRNA之间相似性比较高，很难像mRNA一样做到较为正确的定量，导致计算差异的时候会有较大的假阳性，一般我们都是以实验验证的结果为准，生物信息分析结果只是为辅助的一种手段。另外，miRNA的验证一般要求使用测序样品的返样样品，而且根据差异倍数的高、中、低3个层次的miRNA来进行验证，有重复样本的，最好使用重复间表达一致的miRNA。

2. 采用DNBSEQ平台进行Small RNA测序，准确性怎么样？

采用DNBSEQ平台进行Small RNA测序，准确性完全不用担忧，甚至在某些方面还存在优越性。比如，某些平台采用桥式 PCR 扩增的建库方式，DNA 指数扩增测序；而DNBSEQ平台采用DNA 纳米球（DNB），线性 DNA 扩增测序，此种扩增技术不会累积扩增错误而产生测序偏向性。其次，某些平台的建库是基于两个 primer 矩阵，而这两个矩阵之间具有一定的固定距离，当测序序列非常长或者非常短的时候，就很难匹配上矩阵。而DNBSEQ平台则不存在这样的问题。另外，DNBSEQ平台进行Small RNA发文的研究案例有很多，充分证实了其可靠性。在本次直播课程中引用的前两个案例采用的就是DNBSEQ测序平台。【BGISEQ-500、MGISEQ-2000等华大自主测序平台都是基于DNBSEQ^TM技术，统称为DNBSEQ平台。】

3. Small RNA测序数据量采用多少？不同的样品测序得到的 reads 数量相差较大，会不会影响分析准确性？

Small RNA测序数据量20M reads就可以满足需要了。由于Small RNA 在不同物种或同物种不同组织、不同发育阶段表达情况都有差异，而用作提取的样本，其细胞数差异通常也很大，因此样品中表达的Small RNA 总量不可能完全一致。另外，Reads 数量与样品上机浓度、样品 GC 含量、样品自身特性相关。所以，不同样品间存在的差异是正常的。Reads数只会影响到数据量，数据量足够分析就可以，不影响准确性。同时，我们分析时采用 UMI 定量，这样即使 reads 数量相差较大，也不影响分析的准确性。

课程预告

进入3月，华大科技春季培训依然如火如荼，明天（3月5日，周四）晚上，《16s测序数据解析》将如期举行。以下课表收好了，不要错过干货满满的直播——

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