前沿新知 | 一文了解单细胞研究最新技术

在过去的十余年中，单细胞转录组学取得了巨大的技术突破，这使得高性价比的快速获得大量细胞遗传信息成为现实，更有利于医学基础研究、疾病诊断和靶向精准治疗等。

通过单细胞测序技术，研究者们可以探究单个细胞内的基因表达情况，同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题，实现解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系。早期的单细胞测序流程仅限一次分析数十到数百个单个细胞，而现在，单细胞研究已迈入“高清”时代，这项技术可同时对数千、上万个单细胞或细胞核进行分析。

目前，随着测序技术的推动与工具的突破，单细胞测序技术仍在高速发展的轨道上持续提升，接下来，科技君归纳总结了最新的4个单细胞研究新技术与您分享。

01

VASA-seq

2022年6月27日，荷兰皇家艺术与科学院等单位的联合研究团队在线发表一个单细胞转录组新技术VASA-seq（vast transcriptome analysis of single cells by dA-tailing）方法。

该技术可以在基于平板和液滴微流控的单细胞转录组测序（scRNA-seq）中捕获非聚腺苷化和聚腺苷化的转录组。VASA-seq是先从单细胞裂解物中分离RNA后，进行末端修复和poly(A)引入，实现在条形码寡聚dT探针中合成cDNA。此外，该技术有一种独特的片段识别器（UFI），允许对具有链特异性的分子进行精确定量，利用体外转录扩增条形码cDNA，并清除扩增后的核糖体RNA（rRNA）。VASA-seq是一种敏感的、可扩展且有利于抓取非poly(A) RNA的单细胞技术，有助于实现单细胞编码和非编码RNA的广谱捕获。^[1]

图1 VASA-seq 技术原理

02

 Smart-seq3xpress

2022年3月30日，卡罗林斯卡学院的科研团队开发了一种单管单细胞技术Smart-seq3xpress。

该技术为Smart-seq技术流程的简化版本，主要是采用惰性疏水介质封盖Smart-seq3化学反应的水相体系，使得反应在极小的空间内发生，从而有效降低反应单细胞分析所需的试剂用量。同时，Smart-seq3xpress将一些时间和试剂消耗大的实验步骤去除，包括过度的cDNA扩增、浓度定量、片段长度质控和cDNA投入量归一化，在Smart-seq基础上使用更少的试剂用量，增加细胞通量，减少PCR cycles，提高通量的同时降低成本。通过一系列测试证明，Smart-seq3xpress不仅可以实现试剂用量少，而且获得的数据质量高，有助于揭示细胞类型相关的同源异构体差异等。^[2]

图2 Smart-seq3xpress与Smart-seq3对比

03

   FLASH-seq

2022年3月20日，Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel的科研团队在线发布一种单细胞新技术FLASH-seq (FS)。

这是一种全长单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法，与Smart-seq3相比，它具有更高的灵敏度，也会花费更少的动手时间。整个实验流程可在约4.5小时内执行完毕，易于自动化并可减小反应体积减少资源消耗。FS还可以使用UMI进行分子计数，同时显示减少的链入侵，在多个样本中以高分辨率表征基因表达特别有用。FS技术主要通过对Smart-Seq2进行几个关键修改而成型：结合逆转录（RT）和cDNA 预扩增（RT-PCR），将Superscript II逆转录酶替换为更具处理性的Superscript IV (SSRTIV)，并缩短RT反应时间，增加dCTP的量以有利于SSRTIV的C加尾活性和加强模板转换反应 ，并用核糖鸟苷取代了模板转换寡核苷酸（TSO）中的3'-末端锁定核酸胍。经过系列测试发现，FS比其他方法缩短了2-3.5小时，并在HEK293T细胞中可以检测到更多的基因，更有利于捕获更多样化的亚型和基因。^[3]

04

   NEAT-seq

2022年5月2日，Stanford University School of Medicine的团队开发出一种单细胞多组学技术NEAT-seq（sequencing of nuclear protein epitope abundance, chromatin accessibility and the transcriptome in single cells）。

此技术可对单细胞中的核蛋白表位丰度、染色质可及性和转录组进行测序，是一种能够在单细胞中量化核蛋白以及ATAC-seq和RNA-seq的方法。该技术使用GFP转染、染色分选、抗体偶联，然后让单链DNA结合蛋白与寡抗体相结合并进行寡抗体染色，最后制备单细胞文库，进行测序和测抗体寡核苷酸。NEAT-seq可以在生物学上测量TF水平连续变化的分子后果，同时对一组蛋白质进行相关设置。由于核蛋白包含许多参与基因调控的蛋白质，因此，将核蛋白水平与表观遗传和转录状态联系起来为研究基因调控机制提供了一种强有力的方法。NEAT-seq为研究表观遗传调控丰度对人类原始样本中染色质和基因表达状态的定量影响提供了一条新途径。[4]

图3 NEAT-seq技术原理

参考文献：

[1] Salmen, Fredrik et al. “High-throughput total RNA sequencing in single cells using VASA-seq.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-022-01361-8. 27 Jun. 2022, doi:10.1038/s41587-022-01361-8

[2] Hagemann-Jensen, Michael et al. “Scalable single-cell RNA sequencing from full transcripts with Smart-seq3xpress.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-022-01311-4. 30 May. 2022, doi:10.1038/s41587-022-01311-4

[3] Hahaut, Vincent et al. “Fast and highly sensitive full-length single-cell RNA sequencing using FLASH-seq.” Nature biotechnology, 10.1038/s41587-022-01312-3. 30 May. 2022, doi:10.1038/s41587-022-01312-3

[4] Chen, Amy F et al. “NEAT-seq: simultaneous profiling of intra-nuclear proteins, chromatin accessibility and gene expression in single cells.” Nature methods, vol. 19,5 (2022): 547-553. doi:10.1038/s41592-022-01461-y

撰稿：P

编辑：市场部

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