开讲了单细胞 | 看视频Get这3个单细胞图谱研究Tips，助您生信分析事半功倍！
在单细胞测序技术的众多研究方向中，单细胞图谱研究领域硕果累累，如小鼠单细胞图谱（2018年）、人单细胞图谱（2020年）和猕猴单细胞图谱（2022年），这些研究为了解物种进化贡献了重要信息，为生物医学发展提供了基础性资源和工具，也为疾病诊疗、靶向药物开发带来新角度和新见解。
科技君
上周的“开讲了单细胞”，科技君介绍了样本前处理，为大家解析了3大关键问题点。
科技君
本周，科技君将为大家介绍图谱研究分析技巧！
与大家一起系统讨论单细胞测序的下游，生信分析之单细胞图谱项目分析技巧，具体根据图谱项目的常见问题和特点，着重讲解游离RNA去除、批次效应处理和细胞注释方法，为进一步构建多组织多器官的单细胞图谱提供助力。
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那么，单细胞图谱研究分析中会遇到哪些问题呢？
今天先跟大家一览单细胞图谱项目的常见分析需求点和对应的软件方法。
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怎么判断是否需要去除游离RNA数据？
如何有效去除？
（点击视频可放大观看）
科技君划重点：
单细胞图谱项目中，大多需要对跨器官跨组织进行同类细胞的比较，因此，要去除游离RNA数据的影响，才能比较真实地反映跨器官组织同类细胞的异同。
游离RNA产生的原因
细胞前处理困难、某些细胞易破碎等，可能导致在生成油包水的过程中，不可避免的把细胞之外的游离RNA同时包裹进去。
游离RNA对分析结果可能带来的影响
鉴定到的大部分细胞可能都带有游离RNA的基因；进而可能引起细胞分群不准确，marker鉴定有偏差，细胞注释困难。
判断是否需要去除游离RNA的标准
观察细胞-背景曲线的第二个峰的位置：如果背景比较高，UMI counts大概会在100以上，则推荐去除游离RNA；如果背景比较少，基本上没有游离RNA的干扰，这个峰的位置大概在10左右，或者10-100之间。
去除游离RNA数据的软件和方法
SoupX
DecontX
CellBender
FastCAR
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如何处理批次效应？
（点击视频可放大观看）
科技君划重点：
图谱项目样本量大，通常涉及到对多个个体进行多次取样、多次上机，并可能同时包括细胞或细胞核数据，最终产生多个批次的单细胞数据。此时通常需要采取去批次效应，减少不同批次处理引入的人为差异。
处理批次效应的软件
Seurat（CCA）
Scanpy（BBKNN）
Harmony
LIGER等
人工校验处理效果
检查marker基因分布（过拟合）
检查是否存在batch/样本特有分群（有则仍存在批次效应）
检查聚类与注释的一致性（桑基图）
多个整合软件结果比较等
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细胞类型有效注释方法和软件有哪些？
（点击视频可放大观看）
科技君划重点：
图谱项目的注释方法和原则：先选择数据库/软件进行自动注释，然后再采取人工校验，确认注释的准确性。
自动注释的软件和数据库，分为以下三类
1. Marker Gene Database-based
scCATCH
SCSA
CellAssign等
2. Correlation-based
SingleR
scMatch等
3. Supervised Classification-based
Garnett
scibet
Cell BLAST
Concerto等
如果做的是比较罕见的物种，需要运用Ensembl或OrthoFinder将本物种与近缘物种进行同源基因的转换和基因ID的对应，再根据已知近缘物种的注释信息进行注释。以上方法依赖同源基因对应的准确性、物种的相似性以及取样部位的一致性等。
人工校验的方法
Marker基因定位
与已发表文献中的数据整合聚类
差异基因GO富集推断功能
实验方法：免疫荧光杂交和RNA杂交
让单细胞更简单
华大科技结合自主单细胞DNBelab C系列单细胞平台，提供一站式单细胞服务，从单细胞方案设计，到样本取材选样及邮寄方式建议等，并可以提供组织解离以及流式细胞分选服务，结合DNBSEQ™高保真测序，采用多种分析思路，为单细胞规模化研究及发文之路提供最优解决方案。
接下来，科技君将持续为大家带来单细胞研究全流程关键点分享，且听且珍惜哦！
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供稿：袁永娴、豆儿
编辑：市场部
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