华大文章 | 单细胞DNBelab C系列助力发现更多干细胞干性相关基因功能及小规模药物筛查应用
造血干细胞（Hematopoietic stem cell, HSC）负责启动造血和维持造血系统的稳态。临床应用中发现，来自脐带血（Cord blood, CB）的CD34+细胞（含有造血干细胞和祖细胞）比来自动员外周血（mPB）的再生能力更强。另一方面，在成功的HSC基因治疗过程中， HSC重建造血系统的能力随着HSC离体培养时间的延长而降低。然而，不同来源和培养时间的HSC造血能力差异尚未得到深入研究，理解其中潜在的机制将有助于揭示与HSC干性相关的标志性基因和信号通路，优化HSC的临床应用。
2023年1月，华大自主单细胞DNBelab C系列平台助力中国科学院大学、华大、深圳儿童医院等多家科研团队，于Clinical and Translational Medicine（影响因子8.554）发表题为“Stemness-related genes revealed by single-cell profiling of naïve and stimulated human CD34+ cells from CB and mPB”的文章，揭示了与细胞来源和培养时间相关的干性相关基因（Stemness-related genes, SRG），为理解HSC的干性提供有益见解。
样本设计
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收集人脐带血和动员外周血中的原始或离体培养2天后的CD34+细胞，进行DNBelab C系列高通量scRNA-Seq，共分析16,196个单细胞。
研究成果与结论
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01
人脐带血和动员外周血原始/离体培养的CD34+细胞转录组图谱
通过聚类分群分析，研究人员将鉴定到的16,196个单细胞分成了12个细胞群；基于标记基因，共注释到包括HSC、多能造血祖细胞（Multipotent blood progenitors, MPP）以及髓系（MEMPs、CMPs、GMPs）、红系（MEPs）和淋巴系（LMPP、MLPs、ProBs）单细胞谱系。研究人员进一步使用超几何分布测试，观察到上述细胞簇的标记基因与7篇已发表论文中相关细胞类型的上调基因之间的高度一致性，特别是在HSC细胞群中，验证了本次细胞注释的准确性。
研究人员对标记基因进一步进行功能富集分析用于检验不同细胞类型的特征，此次结果，观察到HSC/MPP中的上调基因与嘌呤代谢过程以及细胞应激反应有关，这已被报道为HSC的标志性特征。相反，下游祖细胞中的上调基因富集于细胞分化和细胞活化相关途径，符合细胞发育过程和细胞周期进展特征。
图1 人脐带血和动员外周血的原始和离体培养的CD34+细胞的转录组图谱
02
HSC的分化轨迹
为了进一步验证单细胞转录组图谱的准确性，研究人员使用Monocle绘制了所有细胞的分化轨迹，观察到细胞呈现7个分支：大多数HSC/MPP位于轨迹尖端附近，而其他细胞则分布于分支2-6中，这与以往研究的报告（HSC首先分化为MPPs，然后分化为LMPP和其他祖细胞）一致。接着，研究人员检查了一些标记基因的表达模式，以确定每个分支的谱系归属。正如所预期的，与HSC和MPPs的自我更新潜力和静止有关的基因如AVP、HLF的表达水平，沿着拟时间都降低了；LMPP和MLPs的标记基因ZBTB16和MZB1在早期被上调，但随着伪时间而降低，这与LMPP和MLPs在轨迹上的位置一致；髓系和红系谱系（如MEMPs、CMPs、GMPs和MEPs）主要位于分支末端，其谱系标记基因（如DUT、CENPF、MPO和HBD）高表达。RNA速率分析得到的发育轨迹与当前人造血系统谱系确定的经典模型一致，进一步说明了上述细胞注释和分化轨迹的准确性。
图2 CD34+细胞发育轨迹分析
03
HSC的特征和基因调控网络
为描绘HSC的特征和基因调控网络，研究人员对HSC的差异上调基因进行了GO分析，结果发现HSC中与细胞周期以及有丝分裂相关的途径最为重要。CD34+的细胞周期活性是动态的，这反映了生物体在不同发育节点的需求。因此，研究人员接着运用Seurat计算细胞周期阶段评分，发现与其他细胞类型相比，HSC在G0和G1阶段显著富集，表明大多数HSC处于静息状态，这与GO分析和先前的研究一致。
随后，研究人员采取SCENIC分析来寻找HSC中特异存在的调控因子，共识别出371个激活的调节子，包括先前报道的（HLF和MECOM）。此外，这些TF及其靶基因集的功能显著富集于皮质酮反应和含嘌呤化合物反应中，这与HSC标记基因的功能一致。此外，该研究还发现了许多新的调控因子如FOS、MEF2C、TEAD4、ELK3和HOXA9，可能为研究HSC提供新的线索。
图3 HSC的细胞周期和基因调控网络
04
调控HSC干性的SRG的鉴定
为了揭示负责HSC干性维持的SRG，研究人员首先比较了原始和离体培养HSC之间的转录组变化。通过差异表达分析，研究人员从CB和mPB CD34+原始HSC中上调基因的交集中获得了247个CT-SRG（Culture time-related SRGs，培养时间相关SRG）。此外，研究人员还通过比较原始CB和原始mPB的HSC获得560个CS-SRG（Cell source-related SRGs，细胞来源相关SRG）。基于两篇已发表论文的HSC数据集采用GSVA分析，显示CT-SRG和CS-SRG的总体表达水平显著高于HSC标记基因，说明CT-SRG与CS-SRG都能更好地反映HSC的干性。
然后，研究人员分析了CT-SRG和CS-SRG之间的共性和差异。结果表明，CT-SRGs和CS-SRGs中的大部分共有基因富含与膜靶向蛋白相关的途径和内质网靶向蛋白，它们是蛋白质合成过程和核糖体编码基因翻译的标志。另外，CT-SRG中特异性存在的9个基因，显著富集于对糖皮质激素的反应和对皮质类固醇的反应，据报道，这会影响HSC归巢和植入。相比之下，CS-SRG特别富集于嘌呤核苷三磷酸代谢过程和ATP代谢过程，这对HSC在应激环境中的稳态至关重要。说明干细胞的培养条件和细胞来源干性差异有不同的影响机制。
图4 与培养时间和细胞来源相关的SRG的鉴定和表征
05
基于CT-SRGs重建CD34+细胞分化轨迹
在造血干细胞移植（Hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）和造血干细胞基因治疗（HSC-GT）期间，CD34+细胞重建造血的能力与离体培养时间呈负相关，为了了解这一过程中的转录组变化，研究人员使用CT-SRG重建了人CD34+细胞的分化轨迹，结果发现，分支2、3在分支1之后的发育轨迹中明显分离。与前文基于标记基因推测的轨迹一致，大多数HSC和MPP仍然位于轨迹的顶部（分支1）；淋巴祖细胞和髓系/红系祖细胞主要分别位于分支2、3。15个CT-SRG在淋巴祖细胞以及MPPs和HSC中表达上调，而分支3中没有CT-SRG上调，说明CT-SRG可能是构建发育轨迹更好的参考基因。此轨迹揭示了相对于髓系/红系谱系，HSC和淋巴谱系之间的关系更为密切，并可用于探索维持HSC干性的新策略。
图5 基于CT-SRGs的CD34+细胞分化和发育轨迹
06
调节CT-SRG的小分子促进HSC的体外增殖和干性维持
基于上述研究结论，研究人员预测调节CT-SRG的小分子可能是调节HSC干性的候选分子，于是使用在线工具包CMap来搜索可能影响CT-SRG表达水平的候选小分子，共确定了145个。其中，蛋白质合成抑制剂（如催吐素和头孢埃林）和糖皮质激素/皮质类固醇受体激动剂（地塞米松）类被预测会积极调节CT-SRG的表达水平。这些数据与前文发现一致，即CT-SRG的功能富集于蛋白质合成过程和糖皮质激素/皮质类固醇反应。
接下来，研究人员选择了三个小分子，NVP-BEZ235（与mTOR/PI3K的信号相关）、葫芦素I（与STAT3/JAK2的信号相关）以及钙调素拮抗剂（与钙通道阻滞信号有关），体外处理CB和mPB CD34+细胞后培养一段时间（最多6天），然后测量CD34+细胞增殖和HSC百分比。结果显示体外培养6天后，只有葫芦素I处理组的CB和mPB中的CD34+细胞的增殖变强，且具有最高比例的CD34+CD38-细胞。这些结果表明，葫芦素I不仅增强了来自CB和mPB的HSC的扩增，而且还可能保持其干性。总之，鉴定HSC调节剂，为提供了CT-SRG的初步应用，并验证了小分子葫芦素I可以增强人HSC增殖，同时保持其体外干性。
图6 葫芦素I增强HSC的增殖性和干性
科技君点睛
BGITech
研究人员将脐带血和动员外周血的原始/离体培养中的HSC进行了比较，鉴定到CT-SRG（247个基因）和CS-SRG（560个基因）可作为选择调节人HSC功能的小分子的数据库。CS-SRG和CT-SRG共享丰富的信号通路，如mRNA分解代谢过程、翻译起始、核糖核蛋白复合物生物发生和靶向膜的共翻译蛋白，这表明动态蛋白翻译和加工可能是保持干性的共同要求。基于SRG，研究人员提出了一个应用，通过使用CMap对CT-SRG进行小规模药物筛查，一种小分子葫芦素I被发现可以有效地增强HSC体外扩增，同时保持其干性。该研究为理解HSC提供了新的视角，为进一步优化HSC的基因治疗和临床应用指明了新的方向。
原文链接（点击文末“阅读原文”即可查看）：
https://doi.org/10.1002/ctm2.1175
供稿：豆儿
编辑：市场部
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