Nat Commun | DNBelab C系列单细胞平台助力阐明炎性并发症结直肠癌患者免疫治疗耐药机制
结直肠癌中一种特殊亚型——微卫星高度不稳定（Microsatellite instability-high，MSI-H）结直肠癌，是一种由错配修复缺陷（Deficient mismatch repair，dMMR）导致的结直肠癌。在临床上，免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor，ICI），尤其是抗PD-1治疗dMMR/MSI-H结直肠癌非常有效，然而，因患者的免疫反应有所不同，有超过50%的此类患者对ICI产生耐药。肠穿孔、肠梗阻引起的肿瘤局部或全身炎症是结直肠癌的常见并发症，由此诱导激活的炎性细胞能够参与免疫抑制并促进肿瘤进展，是MSI-H结直肠癌对ICI耐药的成因之一，但是肿瘤局部炎症在MSI-H结直肠癌患者对ICIs反应中的影响路径仍未得到深入探究，其机制尚未得到阐明。
近期，华大自主单细胞DNBelab C系列平台助力中山大学肿瘤防治中心、华大等科研团队，于Nature Communications（影响因子17.694）发表了题为“Inflammation promotes resistance to immune checkpoint inhibitors in high microsatellite”的文章（点击文末“阅读原文”查看文献）。
该研究证实了MSI-H结直肠癌患者的局部炎症状况会损害肿瘤对ICIs的反应，揭示了炎症通过中性粒细胞相关的免疫抑制与对ICI的耐药性相关，并提出了炎症状况和中性粒细胞-淋巴细胞比值（Neutrophil-Lymphocyte Ratio，NLR）作为ICI反应差的临床特征，为免疫治疗耐药的MSI-H结直肠癌提供了新的临床特征和药物潜在靶点。
方案设计
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研究人员选用并切除了4名接受PD-1免疫治疗的MSI-H结直肠癌患者的原发病灶样本，进行DNBelab C系列高通量单细胞转录组测序（Single-cell RNA Sequencing，scRNA-Seq），其中患者1在没有适当抗生素治疗的情况下出现炎症，在PD-1阻断治疗后出现疾病进展（Progressive disease，PD）；患者2接受了4个疗程的PD-1阻断治疗后，肿瘤消退分级（Tumor regression grade，TRG）为3，在2个疗程后出现腹膜炎，并立即接受抗感染治疗；患者3、4经病理分别证实为TRG 3、TRG 2，均无局部炎症。4个患者的癌组织样本共捕获鉴定12,118个细胞。
技术路线
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研究成果与结论
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01
肿瘤部位的炎症反应与MSI-H结直肠癌患者对ICIs治疗的耐药性相关
一例MSI-H降结肠癌合并肝转移患者，因为肿瘤穿孔接受了横结肠造瘘术，其后在接受PD-1抗体治疗中原发灶与肝转移灶呈现明显的差异化特征：原发灶持续进展，而转移灶持续退缩。因此，研究人员假设原发灶局部炎症反应可能与对PD-1治疗的耐药有关。基于以上假设，研究人员分析了62名接受免疫治疗的MSI-H结直肠癌患者队列临床数据发现，肿瘤局部炎性反应与较差的免疫治疗疗效相关。
然后，研究人员基于接受PD-1治疗的4名MSI-H结直肠癌患者（具体情况如样本设计中所述）原发癌组织构建了类器官。接着，研究人员将4名患者的类器官分别与肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）或外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）衍生的T细胞共培养后，进行流式凋亡检测，结果发现相比于TIL组，患者1的PBMC组中类器官细胞的凋亡比例更高；而患者2、3和4中的凋亡比例在两组之间相当。以上现象表明，患者1的肿瘤局部而不是全身的免疫反应受到了抑制。
图1 炎症反应与dMMR/MSI-H结直肠癌患者对PD-1治疗的不良反应相关
02
单细胞RNA测序揭示了中性粒细胞在肿瘤免疫状态中的抑制作用
研究人员接下来对炎症反应与ICIs耐药相关的机制进行深入探究，首先对比了不同炎症条件下原发肿瘤的微环境组成差异。研究人员对4位患者的原发肿瘤进行了DNBelab C系列高通量scRNA-Seq，得到的数据经聚类分群后，发现患者1的肿瘤被分为上皮细胞和免疫细胞。对免疫细胞做进一步分群鉴定到髓系细胞簇，其中包括中性粒细胞样细胞。相比于其他无炎症反应的MSI-H结直肠癌患者，患者1的组织中具有较多髓系细胞及免疫抑制细胞 [CD8+T竭耗细胞、调节性CD4+T细胞（Treg细胞）]。
接着，研究人员对21名患者的手术切除组织进行了免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）检测，观察MSI-H结直肠癌中的中性粒细胞浸润差异。结果表明，ICIs治疗反应差的患者中性粒细胞浸润增加。为了进一步验证中性粒细胞对MSI-H结直肠癌免疫状态的影响，研究人员采用免疫细胞丰度标识符（ImmuCellAI）工具分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据，发现ICIs治疗不良反应与中性粒细胞浸润升高有关。此外，中性粒细胞浸润和细胞毒性T细胞、Th1细胞、NK细胞、B细胞的浸润呈负相关。综上，研究人员提出中性粒细胞在炎症相关的免疫抑制过程中发挥了主要作用。
图2 中性粒细胞浸润增加与肿瘤免疫状态受抑制相关
03
中性粒细胞在炎症条件下通过CD80/CD86-CTLA4轴调控T细胞
该研究通过细胞通讯分析来探究中性粒细胞如何抑制免疫反应。分析结果显示，在患者1中，髓系细胞与其他细胞类型联系最为紧密，特别是与耗竭性CD8+T细胞。进一步分析发现，髓系细胞主要通过CD80/CD86-CTLA4信号通路与T细胞发挥调控作用，CTLA4可能有助于肿瘤免疫抑制。
据报道，N2型中性粒细胞比N1型中性粒细胞在调节原发性肿瘤的生长和转移进展方面发挥更重要的作用。因此，研究人员基于N1/N2相关标记物对患者1的髓系细胞进行再聚类。结果证实，髓系细胞中具有较多N2型中性粒细胞，且N2型中性粒细胞的CD80等免疫抑制相关配体的表达水平相对较高，这表明N2型中性粒细胞可能更多地参与免疫抑制。
由于CD80/CD86-CTLA4轴参与髓系细胞和T细胞之间的调控作用，并且CTLA4抑制剂在肿瘤免疫治疗中的应用十分广泛。因此，研究人员研究了炎症条件下靶向CD80/CD86-CTLA4的效果，将小鼠肠癌细胞分成两组，一组不处理，另一组经中性粒细胞共培养刺激，接着与PD-1中和的小鼠T细胞共培养一段时间，然后进行凋亡测定。结果表明，与中性粒细胞共培养降低了肠癌细胞的凋亡比例，而这种效应可以通过中和CD80和CD86来逆转。以上情况表明，中性粒细胞在炎症条件下通过CD80/CD86-CTLA4轴抑制免疫反应。
图3 中性粒细胞通过CD80/CD86-CTLA4轴发挥肿瘤免疫抑制功能
04
高NLR与免疫状态差和对ICIs的耐药性有关
根据以往研究，NLR与肿瘤中浸润的中性粒细胞呈正相关。由于中性粒细胞浸润与较差的免疫状态和对PD-1抑制剂的抵抗有关，研究人员假设检测NLR也可以预测肿瘤免疫状态。所以，研究人员对142例经手术切除的dMMR/MIS-H结直肠癌患者队列进行分析，发现术前NLR>3患者的CD8+TIL浸润程度显著降低。此外，研究人员还分析了58个MSI-H结直肠癌患者的临床数据，发现NLR>3的患者更有可能出现炎症，和更高的肿瘤不良反应 [SD（Stable disease）和PD] 比例。
不仅如此，研究人员采用了受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线，比较NLR和局部炎症条件在预测患者对ICI的不良肿瘤反应情况。数据显示具有炎症状态的曲线下面积（The areas under the curve，AUC）为0.649，而具有NLR>3的AUC为0.735。当两个预测因子组合时，AUC为0.771。以上结果表明，NLR>3与MSI-H结直肠癌患者的免疫状况差、PD-1抑制剂反应效果差相关，炎症条件和高NLR都可以预测MSI-H结直肠癌对ICI的不良反应，当这两个预测因子结合时，预测值进一步增加。
图4 高NLR与免疫状态差和对ICIs的耐药性有关
科技君点睛
BGITech
研究人员开展了一项MSI-H结直肠癌免疫治疗抗性机制的研究，结合患者临床数据及单细胞组学信息，分析了炎性并发症下MSI-H结直肠癌的细胞亚群及相互作用网络，证明患有炎症的MSI-H结直肠癌患者的炎症反应与对ICI的耐药相关：炎症环境下中性粒细胞浸润增加，并通过CD80/CD86-CTLA4信号通路调控相关T细胞耗竭，抑制肿瘤免疫状态，进而导致对ICIs产生耐药性；并进一步发现了炎症环境和高NLR都可以作为临床上预测MSI-H结直肠癌对ICIs不良肿瘤反应的潜在分子标志物，也为临床提高结直肠癌免疫治疗疗效提供了理论基础。
原文链接（点击文末“阅读原文”即可查看）：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-35096-6
供稿：豆儿
编辑：市场部
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