Advanced Science | DNBelab C系列单细胞平台助力发现神经管畸形致病机理
神经管的闭合是一个高度复杂和协调的过程，其失败构成了常见的出生缺陷。p21活化激酶2（p21-activated kinase 2，PAK2）是调控细胞骨架的关键调节因子。研究团队观察到Pak2纯合缺失的小鼠胚胎未能在产前存活，主要死于胚胎期（E）8.5–10.5，即神经管闭合时期。这一观察表明PAK2可能具有调节神经管形成的潜力，然而其中的机制仍不清楚。
近期，华大自主DNBelab C系列单细胞平台助力中国科学院北京生科院孙中生团队、温州医科大学、首都儿科研究所等团队联合于Advanced Science（影响因子17.521）发表名为“Loss-of-Function of p21-Activated Kinase 2 Links BMP Signaling to Neural Tube Patterning Defects”的文章（点击文末“阅读原文”查看文献）。
该研究综合运用神经生物学、人类遗传学、多组学（bulk转录组、单细胞转录组）等技术手段，揭示了PAK2调节神经管形成的重要途径，突出了PAK2在神经管发育及其功能异常所致神经管畸形的致病机理，为探究神经管畸形的病理机制提供了崭新视角。
单细胞测序样本设计
BGITech
该团队使用DNBelab C系列平台对E9.5的野生型（wildtype，WT）和Pak2−/−胚胎（一个重复中有3个胚胎，每种基因型有2个重复）进行了高通量单细胞RNA-Seq。经过质量过滤后，生成48,060个细胞的数据集（WT胚胎为25,581个细胞，Pak2−/−胚胎为22,479个细胞）。
研究结论
BGITech
研究团队发现，Pak2纯合缺失小鼠胚胎未能在产前存活，并且在E9.5时期，胚胎的体节数显著减少，胚胎发育迟缓。检查其神经管形态，发现Pak2−/−胚胎表现出颅脊柱裂的特征表型。进一步研究发现，在E9.5时，Pak2纯和缺失小鼠背外侧铰链点（dorsolateral hinge points，DLHPs）形成失败。以上提示Pak2基因对于整个头尾胚轴的背外侧弯曲和神经管形成可能是必要的。
关键研究成果
BGITech
1. Pak2-/-小鼠胚胎中BMP信号活性增强
为了研究Pak2影响神经管闭合的信号通路，对WT和Pak2−/−小鼠的E9.5期胚胎进行RNA-Seq。Pak2纯和缺失小鼠的GO富集分析显示差异表达基因富集于初级神经管形成、前脑、中脑、后脑发育、模式特化过程和脊柱发育过程。此外，BMP信号通路，包括关键成分Bmp4和Bmp5，也均在Pak2−/−胚胎中显著富集。进一步地，蛋白质印迹和E9.5时期后脑的免疫荧光分析确定在Pak2−/−胚胎中，BMP信号转导的主要下游效应物p-Smad1/5/9（Ser465）的水平显著增加。总之，这些结果表明Pak2缺失激活BMP信号途径。
另外，考虑到细胞增殖是神经管闭合所必需的，且BMP信号抑制细胞增殖，于是研究人员测定了胚胎细胞增殖的情况。免疫荧光实验显示，与野生型胚胎相比，Pak2−/−胚胎中细胞增殖受到抑制，细胞死亡增加，表明增强的BMP信号抑制神经管中的细胞增殖并诱导细胞死亡。
图1 Pak2-/-小鼠胚胎激活BMP信号活性
2. 单细胞转录组揭示了Pak2−/−胚胎的异常分化轨迹
为了确定由Pak2调节的神经管发育中的细胞类型和转录特征，研究人员使用DNBelab C系列平台对E9.5的WT和Pak2−/−胚胎进行了单细胞转录组分析。将捕获到的细胞进行聚类分析后，共得到17个细胞簇。
与野生型胚胎相比，Pak2−/−胚胎中神经管及其发育的前脑、后脑和脊髓中大多数细胞类型的细胞比例降低，表明其增殖和分化异常。相反，与早期发育阶段相关的细胞类型，包括中胚层、神经中胚层祖细胞和神经祖细胞，在Pak2−/−胚胎中增加，表明其发育迟缓。神经祖细胞可有助于前神经管的形成，产生脊髓和轴旁中胚层，则Pak2−/−胚胎中神经祖细胞数量的增加表明Pak2在神经祖细胞分化和前神经管形成、以及脊髓发育中发挥着不可或缺的作用。
为了进一步评估Pak2调节的细胞分化和神经管的发育状态，对WT和Pak2−/−胚胎的细胞群进行拟时间分析。结果表明，在大多数发育阶段，与野生型胚胎中的细胞相比，Pak2−/−胚胎中细胞类型比例变化与上述一致，Pak2纯和缺失后影响中胚层细胞向神经管及前脑和脊柱分化的轨迹。
图2 Pak2−/−胚胎发育异常
3. Pak2−/−胚胎的转录变化和异常分化轨迹
为了研究异常分化过程中的转录变化，研究人员将细胞分为4个时间阶段。其中，1期细胞中的基因主要参与上皮细胞形态发生和神经嵴发育的生物学过程；2期细胞中的基因主要与神经管的发育过程有关，包括初级神经管和神经板的发育形成；3期细胞中的基因主要与前脑、端脑、下丘脑和中脑发育的功能有关；4期基因与肌肉系统和血液循环过程有关。
结果发现，与野生型胚胎相比，Pak2纯和缺失胚胎的神经管及前脑（尤其是间脑部分）的发育程度降低，基因表达富集于BMP和WNT信号以及肌动蛋白丝的组装和组织，特别是BMP信号通路，如Bmp4和Tgfb2，以及Sox2的表达下调，揭示了Pak2−/−胚胎异常的转录变化和分化轨迹。
图3 Pak2−/−胚胎的转录变化和异常分化轨迹
接下来，该团队在流产的神经管畸形胎儿中检测到5个位于Pak2基因的点突变，并发现携带Pak2突变的胎儿脑组织中PAK2的水平降低而BMP信号通路中多个基因的水平增加。同时，研究发现Pak2突变点可影响PAK2激酶活性。失活的PAK2无法通过Ser417与SMAD9相互作用，因此SMAD9磷酸化水平降低，进而促进BMP信号传导。
最后，研究人员用CRISPR-Cas9系统在斑马鱼中构建了pak2a的特异敲除模型。该模型在出生48小时后，头部背前侧区域出现了一个明显的空腔，说明其神经管发育异常，该现象可通过野生型而不是突变型Pak2的过度表达发生逆转。总之，以上结果证明了Pak2在调节神经管形成过程中的功能和机制，突出了Pak2缺失对神经管缺陷（neural tube defects，NTDs）发病机制的不利影响。
科技君点睛
BGITech
研究人员观察到Pak2−/−小鼠胚胎无法发育出DLHP，并表现出颅脊柱裂表型。Pak2纯合缺失激活BMP信号，包括其关键成分和主要下游效应物Smad9。单细胞转录组揭示了Pak2纯合缺失在神经管发育中诱导异常的发育轨迹和转录特征。同时，研究人员在五名NTD胎儿中鉴定到PAK2基因点突变，这些突变引起大脑中PAK2表达下调和BMP信号上调。进一步的免疫共沉淀（CoIP）测定表明，Pak2调节SMAD9磷酸化以抑制BMP信号传导，并最终诱导DLHP的形成。斑马鱼中pak2a的缺失导致神经管缺陷，可通过野生型pak2的过度表达来逆转。
以上结果综合表明PAK2在多种脊椎动物的神经形成中的作用十分保守，突出了神经管发育缺陷的分子机制。
原文链接（点击文末“阅读原文”即可查看）：
https://doi.org/10.1002%2Fadvs.202204018
供稿：豆儿
编辑：市场部
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