千里之行，始于“样本” | FFPE样本如何解密？一文看懂！
在生物医学领域，组织病理学分析是非常重要的一个分支，而FFPE技术则是其中的核心技术之一。
科技君
接下来，科技君将带大家深入了解样本处理中的FFPE技术👇
FFPE（Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）是一种常用的样本处理技术，其通过将组织样本浸泡在福尔马林中固定，然后将其包埋在石蜡中来进行样本的保护和储存。FFPE样本是医学领域常见的生物材料，也是目前长期保存病理标本的金标准。
医院病理科档案中往往积存了大量的石蜡包埋组织[1]，数量巨大的归档FFPE样本为回顾性研究、阐明疾病机制、发现治疗靶标和指示预后等方面提供了宝贵的资源。FFPE技术为各项研究提供了稳定核酸的重要来源，目前应用于各种组学研究中。
一
FFPE样本制备流程[2,3]
步骤①：组织收集
从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。操作中每一步的时间应记录在案，这些时间的详细记录是组织质量的重要指标，因为它们会影响所得生物分子的质量；
步骤②：固定
组织样本用典型的10％福尔马林液溶液浸泡固定，根据组织大小和种类的不同应标准化充分固定：活检标本为6-18h，手术标本为12-36h；
步骤③：脱水
使用浓度梯度的乙醇将样本进行逐步去水，去水周期不宜过快或过慢；
步骤④：清除
常用二甲苯作为去除脱水剂，去除残留的乙醇；
步骤⑤：石蜡浸润
用低熔点石蜡来浸渍组织，应记录石蜡的类型，避免使用蜂蜡等添加剂；
步骤⑥：石蜡包埋
将渗透后的组织样本浸泡在液态石蜡中，使其浸渍，然后连同包埋模具一起冰冷后固化，冻脱水后，再切割为薄片后成为固定石蜡样本，可长期保存。
科技君提示：注意防污染👇
1. 防交叉污染：①不同样本制备FFPE时分开制备；②切片时每个FFPE样本用新刀片进行切片。
2. 防微生物污染：①确认样本本身是否无微生物；②确保在FFPE样本制备时的环境、实验用具无微生物；③确保保存FFPE样本的容器、环境条件等符合要求，防止生物二次污染。
二
FFPE技术的优势&劣势
优势
1.易于制备，长期储存：可以用于保存和处理大量的组织样本，使得这些样本可以长期保存，并且可以在需要时进行分析；
2.保存成本低廉：和冷冻组织相比，FFPE样本的保存成本低廉，并且更加方便；
3.环境依赖性低：可以在常温下运输和存储，而不需要冷冻或其他特殊条件；
4.支持多类型组织：可以被广泛应用于不同类型的组织样本，包括固体肿瘤、组织切片等，同时也可用于多种分子学检测类的分析研究。
劣势[2,4,5]
1.分离难度大：福尔马林固定导致核酸之间、蛋白之间以及核酸和蛋白之间的交联。固定时间越长，交联程度越高，纯化难度越大。样本细胞形态和蛋白质结构可能会发生改变从而可能会影响病理诊断和分子生物学研究的结果和准确性。
2.脱氨基诱变：福尔马林固定会使胞嘧啶脱氨基引入C>T、G>A等突变。
3.DNA交联：福尔马林固定诱发DNA加合物生成，导致氨基间生成亚甲基桥；
4.降解风险：样本固定的过程会对DNA和RNA造成破坏，且石蜡的高温渗入会加速核酸的降解，所以FFPE样本提取后的核酸质量往往较差，会影响后续的分子学实验分析以及结果准确性；
5.DNA损伤：可能出现脱嘌呤和脱嘧啶的位点；
6.不同FFPE样本之间存在差异(生物学重复性低)：FFPE技术无法控制不同样本的处理过程对样本的影响，这可能导致样本间差异性大，会影响结果的可靠性和数据分析的结果。
三
核酸提取
核酸提取的步骤为脱蜡、裂解-解交联、纯化、回收。
步骤①：脱蜡
用手术刀片刮取玻片上的样本至取样管中，加入去蜡剂或二甲苯，在一定温度中孵育进行脱蜡；
步骤②：裂解-解交联
用裂解液与蛋白酶在一定温度中进行裂解与解交联；
步骤③：纯化
离心吸附柱法纯化核酸；
步骤④：回收
洗脱回收核酸。
注：上述流程仅供参考。
四
核酸质控
DNA质检
定量：荧光法技术；定性：琼脂糖电泳技术。
RNA质检[6]
通过微流控芯片检测或毛细管电泳技术，同时结合DV200的比例进行定量定性的检测（DV200：是评价RNA质量的一个指标，是指RNA分子中长度在200nt以上的片段所占总RNA比例的百分比，针对FFPE样本，尽量要求DV200≥45%）。
五
FFPE样本送样建议
注：华大科技会定期更新发布各产品送样建议，以最新送样建议为准。
参考文献：
[1] Stefano Amatori, et al. The Current State of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) from FFPE Tissues. Int J Mol Sci. 2022 Jan 20;23(3):1103. doi: 10.3390/ijms23031103.
[2] Hewitt, S. M., Lewis, F. A., Yanxiang, C., Conrad, R. C., Cronin, M., Danenberg, K. D., Goralski, T. J., Langmore, J. P., Raja, R. G., Williams, P. M., Palma, J. F., & Warrington, J. A. (2008). Tissue Handling and Specimen Preparation in Surgical Pathology: Issues Concerning the Recovery of Nucleic Acids From Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132(12), 1929-1935.
[3] Klatt, E. C. Histotechniques: Tissue Processing. Mercer University School of Medicine, Savannah. Retrieved from http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html Accessed Dec 28, 2016
[4] Srinivasan, M., Sedmak, D., & Jewell, S. (2002). Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology, 161(6), 1961–1971.
[5] Hoffman, E.A., Frey, B.L., Smith, L.M., and Auble, D.T. 2015. Formaldehyde crosslinking: A tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem.290, 26404–26411.
[6] Von Ahlfen S, Missel A, Bendrat K, and Schlimpberger M.(2007) Determinants of RNA quality from FFPE samples.PLoS One, 2 (12): e1261.
供稿：牧玫草央
编辑：市场部
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