一文读懂基因测序技术的前世今生 基因测序巨头的故事
作者：heidi
导 读
随着人们对自身基因遗传信息的了解和掌握，使得基因检测技术不断发展和完善，基因检测技术也得到了迅猛发展，下面就和小编一起看看这些年测序技术的发展历程。
测序技术的每一次变革，都是对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发等领域的巨大推动作用。从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法），发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
根据原理的不同，人们将测序技术发展分为三个阶段，第一代，sanger测序。第二代，高通量测序（NGS）。第三代，单分子/纳米孔测序。由于三代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是三代测序技术并存的局面。
第一代：sanger测序
第一代测序技术，主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高准确性高达99.999%，目前仍是测序的金标准；缺点是通量低、成本高，影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。
第二代：高通量测序（NGS）
高通量测序技术（又称为下一代测序，Next Generation Sequencing，NGS）自2005年454公司推出第一台基于焦磷酸测序二代测序仪开始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，高通量测序技术经历了十几年的技术发展过程，NGS测序平台也经历了一系列的收购和合并，最终形成主要三家测序平台，包括：Illumina的Solexa平台、Life Technologies的 Ion Torrent平台和华大基因的Complete Genomics平台。
1.Illumina平台
由于其技术成熟，平台之间高度互补性与交叉性，使得其在短读长测序上大占优势，是目前应用最广泛的NGS平台。目前其占据了测序仪市场约70%的市场份额。
2.Life Technologie平台
Life公司Ion Torrent测序平台采用的为半导体测序原理，其在非碱基多聚体（non-homopolymer）的测序上正确率与其它NGS平台相差无几，而对于连续碱基的检测还不够完善，在检测同一碱基连续出现时的数量可能会有所误差。相对于其他平台，测序通量较小，平台数量也较少。
3.Complete Genomics平台
Complete Genomics平台采用了高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后用复合探针-锚定分子连接（cPAL）技术来读取碱基序列。虽然这些技术非常准确，但该技术在应用上最大的限制可能就是其过短的读长。
高通量测序技术经历了十几年的飞速发展，人类基因组测序成本已经从人类基因组计划的约30亿美元降到了1000美元左右。目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高，同时测序成本也随之大幅度下降，成为商用测序的主流。
第三代：单分子/纳米孔测序
测序技术在近两年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。
由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，第三代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。
第三代测序优势：
1）第三代基因测序读长较长，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均读长达到 10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。
2）直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了 PCR 扩增带来的出错。
3）拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
4）三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测；在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。
第三代测序缺陷：
1）总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因；第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率（低于1%）。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。
2）三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。
3）成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。
4）生信分析软件也不够丰富。
三代测序和二代测序相比较，第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，三代读长超长，准确低，费用高，但因读长长，利于组装和发现unique reads潜在优势明显，但是劣势也限制了三代测序的商业应用。
未来前景
目前，第二代的基因测序技术高通量测序（NGS）是市场商用主流。第三代的单分子/纳米孔测序将是未来的大势所趋，但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存，但二代测序仍将是测序市场商业应用主流。
基因测序巨头的故事
原创：罗奇斌
来源：基因空间
从全球基因测序巨头Illumina公司公布的2014年的财报，来看一下这些振奋人心的数据：全年的收入增速为31%，毛利率为69.2%，收入增长32%，至5.12亿美元，Non-GAAP净利润达到了1.29亿美元，对应0.87美元的每股收益。而在一年前，这两个数字分别是6500万和0.45美元。公司对2015年收入增速的展望为20%，每股收益水平在3.12～3.18美元。
从Illumina的发展历程来看，押宝在DNA测序行业这回算是押对了。简单回顾一下Illumina的发展历程：Illumina成立于1998年，当时的公司没有任何产品，连原型都没有。公司创始人把Jay Flatley招致麾下，因为他成功地以3亿美元的价格将他的上一家公司分子动力（Molecular Dynamics）出售。
当时Illumina不是对每个DNA都进行测序，因为那时测序的成本极高，只能迅速地对个别基因生成快照，而利用类似的技术有一家公司已经是行业的巨头，即Affymetrix。
在2000年时，具有医学背景的JayFlatley在基因概念股大热期间募集了1亿美元。那个时候基因行业中的领头羊是DNA测序设备制造商Applied Biosystems，Illumina只能在夹缝中寻求生存，但是研发毕竟是烧钱的，到了2003年，投资者对于公司已经失去了信心。导致股价从22美元一路暴跌到1美元以下。
在此期间，Flatley甚至炒掉了联合创始人、首席科学官Anthony Czarnik，后来Czarnik 在2002年起诉公司，并赢得了720万美元的赔偿判决（占到当时Illumina年度净亏损的20%）。Flatley说，这是他职业生涯的最低谷。
进入2006年以后，Illumina才算是正式加入DNA测序市场，把当时每个基因组的费用从1000万美元降到了今天的1000美元。这期间Illumina的成功秘诀在于2006年所做的决定：收购Solexa进入基因测序领域。
2007年年初，Illumina拿出6亿美元的股票收购了一家拥有实验性DNA测序仪的公司。这种测序仪能够将DNA打断成微小的碎片并重组，然后利用生物信息技术进行破译。
后来的Illumina将其未来押注在“一项没有销售额，也没人知道它是否有用的技术上”。时至今日，事实证明了Flatley的眼光是对的，自从2008年以来，Illumina的销售额和利润双双增长了147%，分别达到了14.2亿美元和1.25亿美元，股价上涨了617%，市值为230亿美元。
61岁的Flatley说：“到目前为止，我们做到的所有事情都表明，在我们5或10年的投资期内，如果我们依然是测序市场上的领头羊，那么我们的投资回报将比其他任何公司都高得多。”
如果说Illumina只是押对了基因测序行业，那还不足以成为颠覆行业的玩家。真正让Illumina成为颠覆行业的巨头，应该是“技术+执行力+资本”的完美结合成就了Illumina无人撼动的地位。
早在2010年，454生命科学公司创始人Jonathan Rothberg和Flatley就碰过一次面，当时Rothberg（2011年《福布斯》杂志的封面人物）向Flatley展示了一种体积更小的基于半导体技术的桌面DNA测序设备，价格仅相当于Illumina设备单价的10%。“我们没有竞争对手。” Rothberg对他说，“这款产品将使世界意识到这种架构是真的。”
虽然我们无法得知Flatley听到Rothberg这样的狂言时有何想法，但是就在454推出该产品以后的几周，Illumina便发布了更具有价格优势的仪器。自此以后，454再也无法超越Illumina的前进步伐。再一次证明了“执行比什么都重要”的断言。
但是仅仅有执行力还不够，其实Flatley的团队从2008年就一直在研发类似的设备，得到Solexa的Illumina公司一点都不傻，其他公司在测序行业的原创能力一直都是很有竞争力的，同时在资本市场，当时的454也是弄潮儿，但是最终还是执行力使454输了这场比赛。
同时代的还有PacBio公司，但是最终还是因为其技术的特点造成测序的错误率太高而无法与Illumina匹敌，后来其重心转向了朝着第三代测序仪的研发发展。
Illumina已经具备了技术和执行力，下一步成就巨头的，就是资本的推力了。如果说测序市场的盘子是Illumina的最终目标，那么这个盘子是养不活一家巨头的，仅仅作为一家测序仪制造商，Flatley已经发挥了他最擅长的一面，摆在他面前的是，要成为颠覆行业的巨头，还缺少一个华丽的转身，那就是让测序技术进入医疗行业。
一场充满博弈的并购案出现了，作为医疗行业巨头之一的瑞士制药罗氏（Roche）公司，提出57亿美元收购Illumina的方案。在Illumina首席财务官Marc Stapley上任的第一天，罗氏便展开了敌意收购。
Illumina的银行家们觉得被罗氏收购只是时间问题，但是Flatley被激怒了，Illumina的股东们被激怒了，其中第三大股东摩根士丹利（Morgan Stanley）的Jason Young扬言：无论价格多少都不会出售Illumina给罗氏。最后罗氏放弃了收购，如今Illumina的市值已经是当时罗氏报的4倍以上。通过这次罗氏的恶意收购，Flatley看到了进军医疗市场的机会。
2012年9月，Illumina收购了英国的遗传变异测序服务公司BlueGnome；2013年1月，收购了Verinata Health公司。Verinata Health公司在产前血液测试领域具有最宝贵的知识产权；2014年7月，罗氏继续收购了一家专注于伴随诊断及其他IVD的咨询公司Myraqa；同年，Illumina联合多个癌症研究中心，宣布成立AGC（规范基因组联盟）联合机构，指导下一代测序技术在肿瘤临床诊断中的应用。
Illumina一系列的出手，加上已经在测序行业高达70% 市场占有率的地位，巨头已经完成了华丽的转身，技术+执行力+资本的组合发挥到淋漓尽致。下一步摆在Flatley面前的是，已经站稳脚跟的基因测序市场，Illumina如何能一直保持领先地位，而刚刚才进入的医疗市场，又如何能够重现高速发展的奇迹呢？
能够在基因测序市场上比拼的永远都是技术为王。从1998年到2014年，诞生了5位真正的玩家。下面来看一下这5位玩家的发展历程。
Illumina和ABI公司最早进入基因测序行业，454晚了一年加入，这3家中也只有Illumina存活到现在。在此期间，ABI公司被Invitrogen并购改名为Life Technologies，后来Life又被Thermo Fisher收购。罗氏在2007年收购了454。
进入2004年以后，PacBio和Oxford Nanopore分别以一种颠覆行业的姿态进入基因测序行业，虽然两者在整个行业中占有的份额不超过3%，但是其受关注的程度非常高。仅仅在2013年，基因测序市场的盘子就达到了13亿美元，其中Illumina占有71%；Thermo占有16%，位居第二；罗氏排名第三，占有10%的市场；排在最后的是PacBio。
从基因测序的市场上来看，Illumina的未来已经到达了一个天花板，仅仅是为了维持超过70%的市场占有率，公司就不得不付出极高的维护成本和研发费用来阻止其他竞争者的抢夺，这显然是不符合资本运作的。
如果Illumina的触手伸向产业的下游，会让那些已经购买过Illumina昂贵测序仪的公司咬牙切齿，因为这些测序服务公司在Illumina专注制造测序仪器的同时，已经悉心孵化出一片稳定的测序服务市场，如果Illumina也要分一杯羹的话，这些公司唯一的出路就是优化和提供更优质的服务和多元化的业务组合，这必将会增加已有的市场维护成本，同时也会让本来已经竞争激烈的测序服务市场上演更激烈的战争。
一旦Illumina的野心让下游的测序服务公司感觉到竞争威胁的压力，很有可能就会倒戈到其他的测序仪制造商，或者在一些具有巨大潜在测序服务需求市场的国家，如中国、韩国和日本等，会逐渐开发国产的测序仪器。
目前在国内已经看到了一些领头的测序服务公司，如华大基因、诺禾致源、贝瑞和康及安诺优达等；同时在国产测序仪器研发方面也有一些实力派的公司开始尝试，如华大通过收购CG，紫鑫药业通过和基因组所合作都分别开始了国产测序仪的挂牌推广。
未来的市场如何走向，Illumina面临的不仅仅是一个开拓新市场的问题，更重要的是一个未来方向的定位。所有Illumina的股东都清楚，基因测序市场已经是红海，那么蓝海在哪里？刚刚进入的医疗行业，基因测序还不能成为行业的标准，更多地需要对新市场的孵化和引导，能否最后成为新市场的颠覆者，这还是一个未知数。
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文琳编辑
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