刚刚！CRISPR基因编辑获得2020年诺贝尔化学奖
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左图为Emmanuelle Charpentie，右图为Jennifer A. Doudna
北京时间10月7日下午5时48分许，2020年诺贝尔化学奖揭晓。法国和美国科学家Emmanuelle Charpentier、Jennifer A. Doudna获奖，以表彰她们“开发出一种基因组编辑方法-CRISPR基因编辑”。
CRISPR- Cas9作为一种新兴的基因编辑技术，通过定向敲除肿瘤免疫检查点分子或者通过快速简便的基因编辑，而被广泛应用于肿瘤治疗领域，其显著降低了肿瘤免疫治疗的操作难度，同时也极大促进了肿瘤免疫治疗研究的发展。
本文盘点一下目前在CAR-T、免疫检查点、抗体靶向疗法这三大主要肿瘤免疫疗法中的应用。
CAR-T细胞免疫疗法是多肿瘤免疫疗法中最热点的研究内容。CAR-T技术通过基因编辑获得修饰后的T细胞，能够特异性识别肿瘤细胞表面特异性受体，并增强其对肿瘤细胞的防御能力。
提高CAR-T细胞的制备效率
提高CAR-T细胞的功能
CRISPR-Cas9 技术也可以通过敲除编码信号分子的基因或T细胞抑制性受体的基因来提高CAR-T细胞的功能。
CAR-T细胞疗法的抗肿瘤疗效显著，但只能够特异性识别肿瘤细胞表面受体，而肿瘤特异性T细胞受体（TCR-T）细胞能够通过基因修饰表达特异性受体，识别肿瘤细胞表面经I类主要组织相容性抗原呈递的抗原肽从而识别胞内特异性分子。但受体T细胞中存在的内源性TCR与修饰后的TCR可能会存在竞争反应，因此采用CRISPR-Cas9 基因编辑技术制备TCR、HLA I 类分子和PD1缺失的CAR-T细胞，使其异体反应降低又不引起抗宿主疾病，体内抗肿瘤疗效也得以提升。
其还能通过敲除免疫共抑制通路或信号分子的基因（如CTLA4、PD1）提高CAR-T细胞的功效。
科学家运用CRISPR-Cas9 技术有效地对CAR-T细胞进行基因编辑，得到多基因敲除CAR-T细胞，防止免疫调节物对 T细胞活化与增殖的影响，成功提高CAR-T细胞对免疫细胞的防御作用，更好地发挥抗肿瘤疗效。
NIH（美国国立卫生研究院）下属Recombinant DNA Advisory Committee批准的由Carl June教授领导的一项CRISPR临床试验。在该试验中，研究人员将利用CRISPR-Cas9在靶向黑色素瘤的CAR-T中敲除编码PD-1的基因以及内源性T细胞受体的基因，敲除PD-1之后，CAR-T的杀伤性更强。
2017年12月，中国科学院王皓毅团队在Frontiers of Medicine上发表了一篇名为CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells的文章，该研究团队建立了利用CRISPR-Cas9系统在T细胞或CAR-T细胞中高效敲除LAG-3基因的方法，其发现敲除LAG-3的CAR-T细胞能够维持抗原特异性细胞因子释放和体内外抗肿瘤功能。
美国斯隆凯特林癌症纪念中心的研究人员利用CRISPR-Cas9技术运送CAR基因到T细胞基因组中的特定位点上，利用这种方法构建出更加强效的CAR-T细胞。而这些CAR-T细胞不容易耗竭，能够长时间地持续发挥抗肿瘤作用。
来自圣路易斯华盛顿大学医学院的科学家们利用基因编辑技术CRISPR对人类T细胞进行了改造，去除了CD7和T细胞受体α链(TRAC)表达，这是一种针对CD7+ T细胞恶性肿瘤，避免了“自相残杀”的CAR-T细胞疗法(UCART7)。其在保护正常T细胞的情况下，对癌性T细胞发起攻击。其研究结果显示：接受基因编辑改造的以CD7为靶点的T细胞治疗组的小鼠，中位生存期为65天，而接受对照组小鼠的中位生存期仅有31天。研究结果于发表在权威学术期刊Nature子刊Leukemia上，
CRISPR技术在CAR-T细胞的基因修饰方面的应用，具有广阔的应用前景。但目前还存在两个限制性问题：
CRISPR技术导入T细胞的方法不能使普通细胞正常增殖，限制了细胞培养和富集过程。导入方法中，非整合转染方法虽安全但效率低，整合转染的方法效率较高但其安全性不能保证。
CRISPR编辑系统存在脱靶现象，一旦发生脱靶，将导致非靶标基因的改变或调控元件的破坏，会造成不可逆转的后果。因此CAR-T细胞的精确编辑和高效导入是基因编辑技术未来主要的研究方向。
PD-1和CTLA-4是如今十分熟知的免疫检查点，能显著抑制T细胞的活性，进而使得肿瘤细胞易于逃逸机体免疫机制，导致T细胞治疗效果较差。目前为了更好发挥T细胞肿瘤治疗的疗效，利用免疫检查点抑制剂的阻断抗体是常用的阻断免疫调节物对T细胞的免疫应答抑制有效方法。
其中通过CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除参与免疫负调节的基因，也能达到同样的抗肿瘤效果，是一种全新的治疗思路。利用电穿孔方法将Cas9和sgRNA导入T细胞并敲除PD-1基因，使其表达减少，长时间的体外培养过程中没有发现PD-1对T细胞活化的影响，使T细胞更好地发挥其抗肿瘤疗效。这种新的阻断疗法常常与过继性T细胞免疫疗法结合使用，可以增强免疫细胞的活性。
CAR-T领域的先驱者Carl June教授在Clinical Cancer Research杂志上发表的文章证实，体外和动物模型研究中，用CIRSPR技术敲除TCR和B2M这两个和免疫排除有关的基因后，T细胞同种异体反应性降低，且没有导致GVHD。
此外，中国和英国科学家也发现，用CRISPR敲除TRAC （T cell receptor alpha constant chain）后可以构建的通用型CAR-T。
同时，这些进展表明了利用靶向基因编辑技术敲除免疫检查点已是改进CAR-T治疗实体瘤非常有希望的策略。
肿瘤细胞表面表达了与正常细胞不同的抗原，而这些抗原可以作为单克隆抗体识别的靶点，被抗体识别并结合，引起肿瘤细胞的死亡，从而达到抗肿瘤的目的。目前，FDA已批准的许多抗体类药物，如抗HER2抗体、抗CD20 抗体、抗VEGF 抗体等。
鉴定肿瘤细胞表面的潜在特异性靶点
CRISPR-Cas9 基因编辑技术可以用来鉴定肿瘤细胞表面的潜在特异性靶点，进一步发展抗体的靶向治疗应用。Steinhart等利用CRISPR-Cas9技术在具有RNF43 突变的胰腺导管肿瘤细胞之间进行全基因组筛查，发现Frizzled-5受体在胰腺肿瘤细胞的生长中起着关键作用。特异性结合Frizzled-5的抗体能够明显抑制荷瘤小鼠中癌细胞的增加。
近日，来自耶鲁大学的陈斯迪研究团队开发出筛选CD8+T细胞上与肿瘤免疫治疗相关基因的CRISPR系统，并找到与肿瘤浸润相关以及发挥CD8+ T细胞毒性杀伤的关键基因，其发现名为DHX37基因能抑制CD8杀伤T细胞对小鼠肿瘤的反应，敲除CD8+ T细胞中该基因后，CD8+ T细胞在体内具有更强的肿瘤杀伤能力。
抗体的制备
研究者们运用 CRISPR-Cas9 技术编辑人类和小鼠的Ig基因，利用CRISPR-Cas9介导的IgM+小鼠B细胞、杂交瘤细胞及人的B细胞重链恒定区基因高效DNA断裂，故发生类转换重组，实现IgM-IgG-IgA 的抗体类型转换。通过CRISPR/Cas9 技术，可靶向编辑杂交瘤细胞或者B细胞免疫球蛋白重链恒定区的基因，获得特定类别的抗体，达到抗肿瘤的目的。
抗体的抗原结合片段（Fab）分子量小，更易渗透进入肿瘤组织，在肿瘤的抗体靶向治疗中起着关键作用。因此有研究了获得只分泌抗体 Fab 片段的杂交瘤细胞，利用CRISPR-Cas9 技术删除小鼠杂交瘤细胞的Fc段的基因，便可以更为高效简便地获得抗体的Fab片段，并易与其他药物偶联进而渗透入肿瘤组织，抗肿瘤效果更为显著。
由于CRISPR-Cas9技术操作过程中存在脱靶效应以及细胞内递送效率低的问题，其在临床治疗上的应用存在限制，如何在不影响CRISPR-Cas9 的简便性和高效性的同时又可以有效地降低其脱靶效应发生率，提升其对免疫细胞的转染效率，达到理想的抗肿瘤免疫治疗效果，这也将是科学家们继续努力的方向。
但不可否认的是CRISPR-Cas9基因编辑技术在肿瘤免疫治疗中担任着越来越重要的角色。随着该技术进行进一步的完善，将会使其更加广泛地应用于基因研究，同时促进抗肿瘤免疫的临床治疗。
参考资料：