Cell：CAR-T细胞疗法持久性为何有限？丨医麦黑科技
2021年12月4日/医麦客新闻 eMedClub News/--如何产生持续的治疗反应是嵌合抗原体（CAR）T细胞疗法目前面临的一个重大挑战。CD19 CAR-T细胞疗法已发展成为复发性或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）的标准治疗，然而CAR-T细胞的有限持久性使许多患者的肿瘤复发成为可能。
St. Jude Children's Research Hospital近日公布了ALL患者CD19 CAR-T细胞经历与衰竭有关的DNA甲基化编程过程的临床试验数据，揭示了控制T细胞持久力的因素，从而影响免疫治疗反应。
这项题为“CD19-CAR T cells undergo exhaustion DNA methylation programming in patients with acute lymphoblastic leukemia”的研究于11月30日发表在《Cell Reports》杂志上。
为了更深入地了解与CAR-T细胞分化相关的分子特征，研究人员对ALL患者输注后CD8 CD19 CAR-T细胞进行了纵向全基因组DNA甲基化分析。数据表明，CD19 CAR-T细胞是否经历与衰竭相关的DNA甲基化编程过程至关重要，这可能是提高CAR-T细胞功效的一种有效方法。
▲纵向CAR-T细胞衰竭相关DNA甲基化分析（ 图片来源：Cell Reports 杂志）
科学家们表明，表观遗传程序控制着T细胞的衰竭。T细胞感到疲倦时，免疫系统的抗癌反应是有限的。为了研究CAR-T细胞在临床反应期间是否会经历衰竭，研究人员检查了从B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中分离的CD8 CD19 CAR-T细胞的表观遗传学定义的分化状态。结果显示，CD8 CD19 CAR-T细胞逐渐获得DNA甲基化特征，发育成了T细胞的衰竭祖细胞子集。
▲载体的平均测序覆盖率与整个基因组的平均覆盖率（ 图片来源：Cell Reports 杂志）
为了确定CAR-T细胞是否在过继转移后进行DNA甲基化重编程，以及这些程序是否与临床结果相关，研究人员对表达具有41BBζ信号传导域的第二代CD8 CD19 CAR-T细胞进行了全基因组DNA甲基化分析，在输注前和输注后对CD8 CD19 CAR-T细胞进行分选，并将满足最小细胞数阈值的样本进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）。对比载体的平均测序覆盖率与整个基因组的平均覆盖率之间的比率，结果显示，载体对CD8 CD19 CAR-T样本的覆盖率约为2倍。
▲ DMR富集（图片来源：Cell Reports 杂志）
研究人员在输注后CAR-T细胞中发生的甲基化和去甲基化事件中均观察到输注后代表性差异甲基化区域（DMR）的重叠在增强子位点显著富集，并且富含调节T细胞效应和记忆分化的转录因子结合位点。因此确定这些甲基化变化发生在基因调控元件上。表明这些表观遗传事件与内源性T细胞分化过程中出现的修饰相似。
在对输注后第1-3周的患者样本中保留的DMR进行基因本体学(GO)分析时发现，CD8 CD19 CAR-T细胞经历了抑制干细胞相关特性（β-连环蛋白-TCF 复合物）和淋巴细胞活化的抑制性编程。PCA结果表明CD8 CD19 CAR-T细胞在基因调控元件处经历广泛的DNA甲基化重编程事件，这些元件影响对CAR-T细胞功能和存活至关重要的生物学过程。
研究人员还对每周从患者中分离的输注前产物（GMP）和输注后CD8 CD19 CAR -T细胞进行基于DNA甲基化的多能指数（MPI）计算。线性回归分析显示GMP产品的MPI评分与1周时间点的扩张之间呈正相关。数据表明，CD8 CD19 CAR-T细胞的广泛DNA甲基化重编程发生在输注后。
在进行基因集富集分析（GSEA）时，与第2周和第3周样本相比，第1周样本对未甲基化区域的富集程度要高得多。数据表明，在一段时间内患者会出现 CD8 CD19 CAR-T细胞记忆潜力丧失的现象。为了确定这种现象是否与衰竭相关的基因表达程序有关，同时为了寻找CAR-T细胞衰竭的证据，研究人员将当前的数据集与从T细胞衰竭的规范模型（小鼠的慢性LCMV感染）中获得的数据进行了交叉引用，结果表明，T细胞记忆潜力的丧失与T细胞衰竭DNA甲基化特征的获得有关。
为了解决CD8 CD19 CAR-T 细胞发育的衰竭阶段，研究人员寻找了DNA甲基化图谱的短暂标志。通过研究抑制性受体PD-1（PDCD1）和TIGIT的位点，发现这些表观遗传程序在衰竭期间变强。结果表明，干细胞相关基因表达的沉默与衰竭分子的逐渐上调有关，这些分子支持CD19 CAR-T细胞沿着发育路径向T细胞衰竭过渡。
虽然CAR-T细胞疗法最初诱导显著的肿瘤控制肿瘤，但个体可能会经历内源性CD19 B细胞恢复和抗原阳性疾病的复发。B细胞重建发生在该队列的一半患者中。为了进一步评估持续性CD8 CD19 CAR-T细胞的体内功能，研究人员检查了CD19白血病复发患者，发现尽管肿瘤抗原重新出现，但CD8 CD19 CAR-T细胞仍未扩增。此外，当第二次输注CD19 CAR-T细胞给这些患者时，观察到该产物的可检测扩增。结果表明，T细胞衰竭表观遗传学程序与细胞召回潜力的抑制相结合，并且可以得到加强。
减轻T细胞功能障碍的不同方法可能针对一组核心基因调节程序，这些程序限制了干细胞并强制CAR-T细胞的衰竭。预防CAR-T细胞功能障碍的策略包括限制T细胞的激活或消除导致衰竭的DNA甲基化程序。
小结
总体而言，这项研究说明了CAR-T 细胞在体内扩增期间经历DNA甲基化重编程。广泛地强调了DNA甲基化程序耦合到CD19 CAR-T细胞记忆潜力的下降和衰竭途径的建立，为未来在输注后产生持久反应的记忆CAR-T细胞提供了一条路径。
参考资料：
1.https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)01570-9
2.https://medicalxpress.com/news/2021-11-exhaustion-affects-car-tcell-clinical.html
3.https://www.stjude.org/