SV碰上三维结构，探究Duplication通过影响TAD如何引发疾病？
染色体结构的改变，会使排列在染色体上的基因数目和排列顺序发生改变，从而导致性状的变异。有的结构性变异往往和疾病（包括一些癌症）的发生相关联，是致病的诱因，甚至会导致生物体的死亡。
结构性变异通常会改变相关基因区域的三维空间结构，进而可能改变基因间的互作，使相关基因的表达水平改变，最终影响个体的表型。
本文将根据发表在2016 Nature上的一篇力作，介绍横跨不同区域的Duplication, 通过影响三维空间结构位点间的互作，导致疾病的发生，如性别逆转和肢体畸形。
研究背景
SOX9是胚胎发育中重要的转录因子，涉及软骨分化和性别决定；KCNJ2和KCNJ16为钾离子通道基因, 和果蝇Irk2是同源基因，也是内源的钾离子通道基因，有研究表明，该基因在BMP通路中，会涉及到很多发育中的其它功能，而BMP通路突变体会导致肢体畸形。
TAD，即topologically associated domain，是高度有序的亚染色质结构，在基因组特定的区域形成的特定边界区域，从而导致了基因组三维结构进行分离。TAD是基因组调控单元，具有很高程度的内在稳定性，能够限制区域内部调控元件（如增强子，沉默子等）与其它区域基因的靶向互作。研究表明，染色体结构性变异能够重塑TAD。
本文探索了3个横跨不同TAD区域的duplication事件对功能的影响，分别为：
导致性别逆转的intra-TAD duplication
引起先天性肢体畸形（Cooks综合症）的inter-TAD duplication
没有表型的inter-TAD duplication（跨越SOX9 TAD和KCNJ TAD, 但未包含KCNJ2基因区域）（下图）。
图 1. Human ES cells中横跨不同区域的Duplication事件
Duplication对TAD内及TAD间位点间互作的影响
1
构建小鼠模型
因为小鼠该区段的TAD和人类一致，包含SOX9 TAD 和KCNJ TAD，为了了解上述duplication事件对TAD结构的影响效应，所以将上述duplication事件在小鼠体内进行了实验。
Dup-S模型：使用CRISPR/Cas9技术得到400kb intra-TAD duplication事件的Dup-S样本，等价于发生性别逆转的个体
Dup-L模型：使用Cre/loxP系统和trans-allelic重组技术得到1.6Mb inter-TAD duplication的Dup-L样本，等价于没有表型的inter-TAD个体（该duplication未覆盖KCNJ2基因组区域）（下图）。
图 2. 小鼠Dup-S和Dup-L样本的Duplication变异情况
2
数据分析结果
Dup-S模型
来自Dup-S的样本capture Hi-C结果显示，整体TAD结构域没有发生变化
从Dup-S样本中减去野生型背景后，在重复区域互作增强。
Dup-L模型
来自Dup-L样本的capture Hi-C结果显示，出现了新的TAD结构域，覆盖SOX9和KCNJ TAD的重复区域
从Dup-L样本中减去野生型背景后，在重复区域出现了很强的互作结构域（不包含SOX9，KCNJ2和KCNJ16基因区域），且邻近的TAD未发生改变，说明neo-TAD与SOX9和KCNJ TAD是隔离的（下图），推导该duplication未导致特定的病理学特征，可能源于TAD之间的互作隔离。
图 3. 小鼠Dup-S和Dup-L样本的 SOX9 TAD和KCNJ TAD区域互作热图
覆盖KCNJ2和KCNJ16的Duplication突变体出现了肢体畸形
01
构建小鼠模型
Dup-C模型
使用trans-allelic重组技术得到了Dup-C突变体，等同于出现先天性肢体畸形的inter-TAD，该duplication事件延伸到KCNJ2和KCNJ16基因区域。
02
数据分析结果
形成了neo-TAD：该TAD覆盖了SOX9 和KCNJ TAD，且新形成的TAD覆盖了KCNJ2和KCNJ16基因区域（下图）。研究推测，虽然TAD之间的互作是隔离的，但neo-TAD因包含KCNJ基因区域，可能导致上述基因的表达发生改变，出现了肢体畸形性状。
图 4. 小鼠Dup-C样本的SOX9 TAD和KCNJ TAD区域互作热图
包含KCNJ区域的Duplication如何影响基因的表达
01
样品来源
选取Dup-C的老鼠肢体刚开始发育时的样本
来自人的患有Cooks综合症病人的纤维母细胞
02
实验技术
针对KCNJ2和KCNJ16基因区域使用4C-seq技术
RNA-seq
03
分析结果
4C-seq的结果证实有新的互作发生，研究发现，SOX9 TAD和 KCNJ TAD间存在异位互作（图 5）。
图 5. 4C seq技术探究SOX9 TAD和 KCNJ TAD区域间互作
转录组验证基因表达改变
那么异位互作如何影响基因的表达? 选用Dup-C老鼠胚胎发育12.5和17.5天肢体刚开始发育时的样本，进行RNA-seq表达分析发现，只有KCNJ2基因表达上调，SOX9和KCNJ16未发生变化（下图）。包含KCNJ2的neo-TAD横跨SOX9和KCNJ TAD，使得原本属于SOX9的TAD调控元件导致了KCNJ2基因的错义表达，出现了肢体畸形性状，而KCNJ16的表达未发生改变。
图 6. 不同类型的Duplication对KCNJ2和Sox9的表达影响
探索引起肢体畸形性状的其他因素
为了研究肢体畸形性状是否仅由KCNJ2基因的错义表达导致，还是同样存在其它因素。
01
构建小鼠模型
构建突变体Dup-K1（包含KCNJ2和KCNJ16基因区域的intra-TAD）
构建突变体Dup-K2（仅包含KCNJ2基因区域的intra-TAD）
构建突变体Dup-C2（仅包含KCNJ2基因区域跨越SOX9和KCNJ TAD的inter-TAD）。
02
分析结果
研究发现Dup-K1和Dup-K2表型正常，但Dup-C2出现了Cooks综合症的肢体畸形表型，表明该疾病的发生是由原本属于SOX9 TAD的调控元件，因duplication事件导致形成neo-TAD，使原本隔离的位点进行了异位互作，导致KCNJ2基因的错义表达，出现了Cooks综合症。
图 7. 突变体Dup-K1, Dup-K2和Dup-C2
上述内容希望能够让您了解到duplication事件对TAD的影响，以及TAD的变化如何影响调控元件和靶向基因的互作，导致疾病的发生。
结
语
SV世界还有众多类型的结构性变异，如Inversion， Deletion，Translocation等结构性变异，它们是如何影响三维结构的？如Deletion导致两个TAD间发生融合，Inversion导致TAD结构重组等。三维基因组将带您从空间调控解析各种基因表达的异常， 打开探索疾病和癌症的一扇新大门。
参考文献
Franke M, Ibrahim D. M, Andrey G, et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature, 2016, 538(7624):265-269
神灯宝典之PB三代重测序分析实录（二）
作者|易之
审稿|童蒙
编辑|amethyst
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