DNA-RNA互作检测技术

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DNA-RNA互作检测技术

随着Hi-C技术的建立和发展，越来越多的技术可以用于DNA-DNA相互作用的研究，类似的RNA-RNA相互作用检测技术业已诞生，而长期以来DNA-RNA互作检测技术没有多少起色。

以下和各位分享DNA-RNA互作检测技术——GRID-seq。

背景介绍

1953年，沃森（Watson）、克里克（Crick）发现了DNA双螺旋结构，开启了分子生物学时代，使遗传研究深入到分子层次，“生命之谜”被打开，人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径。

随着生物学技术的发展，科学家们发现真核生物的基因组是被高度折叠封装在细胞核中的，其中的结构纷繁复杂。研究至今，关于DNA、RNA序列与染色质结构的关系、潜在机制仍不明朗。

直到2009年，3D genome领军人物Dekker在顶级期刊Science杂志上发表了Hi-C技术。Hi-C技术为研究者在全基因组范围内捕获DNA-DNA互作对提供了极其便利的工具。至此，3D genome这一新兴领域的大门被打开，一路蓬勃发展，已经衍生出了众多DNA-DNA互作检测技术，使得研究者发现更多复杂的DNA-DNA互作关系。

到了2011年，关于RNA-RNA相互作用的技术和研究也陆续发表了出来，但是很长一段时间内关于DNA-RNA互作的技术没有明显起色。

众所周知，细胞内的转录机制非常复杂，也十分丰富，不仅表达编码蛋白的mRNA，而且也存在大量的非编码RNA（ncRNA）在行使调控功能。有证据表明，许多ncRNAs可直接与染色质互作。一些ncRNA可能主要通过顺式途径介导基因组互作，表明特定的RNA-染色质互作在基因表达调控中扮演重要的角色。

通过Hi-C分析染色质结构，可以检测所有可能的DNA-DNA相互作用，通过ChIA-PET分析特定因子介导的染色质相互作用，但是这些技术检测的主要都是非细胞类型依赖的拓扑相关结构域 (TAD) 内的，而染色质上结合的RNA还可能帮助我们找到转录活性相关的相互作用，帮助我们区分超级增强子和普通增强子。

2017年，来自加州大学的付向东研究团队，研发了一种无偏差地检测全部染色质-RNA相互作用的技术：GRID-seq（Global RNA interactions with DNA by deep sequencing），相关论文发表在了Nature Biotechnology上。

GRID-seq技术原理

捕获全基因组范围的DNA-RNA相互作用，流程图如下：

简要步骤如下：

1. 设计特殊的linker，一端是单链RNA，另一端是双链DNA

2. 使用DSG和甲醛固定RNA-DNA相互作用，提取细胞核

3. 使用AluI 进行酶切

4. 加入linker进行连接，linker的RNA与待捕获的RNA连接

5. 生物素富集，对单链RNA部分反转录

6. 去除游离的linker

7. 使用磁珠捕获DNA

8. 从磁珠释放ssDNA，合成dsDNA，使用MmeI酶切，将linker上的酶切位点切开

9. 筛选目标片段，85bp的是连接了RNA和DNA的linker，65bp的是只连接了RNA或者DNA的linker

GRID-seq数据

分析展示

作者使用了人、小鼠和果蝇三个物种的数据进行分析和探讨（文末已附上代码和数据集来源）。

GRID-seq reads来源

• RNA reads主要来源于基因区域（外显子、内含子），表明它们源于多种多样的不完整的剪切RNA。

• DNA reads主要来源于启动子和基因间隔区域（下图b）。

• 染色质互作RNA数据与新生RNA数据（GRO-seq）的相关性比与RNA-seq数据的相关性更高（下图c, d）。

这表明，GRID-seq更倾向于检测染色质上的新生RNA。

全基因组染色质-RNA互作

去除非特异性的信号后，检测到868个mRNA和72个ncRNA高度富集在MDA-MB-231细胞系的染色质上。互作图显示，只有少量的RNA与基因组发生反式相互作用（下图a）。同时选取两个代表性的染色体（100kb分辨率）进行展示（下图b）。

图a. 热图纵轴：染色质富集的RNAs; 热图横轴：人基因组1-Mb分辨率。主要的反式互作标记在右侧，其中U2-36P和U2-2P是U2 snRNA的两个变体。图b. 两个代表性染色体RNA-染色质互作展示，chr11（左）和chr17（右）。pc：编码蛋白RNA，nc：非编码RNA。

将GRID-seq数据与已公布的roX2 ChIRP、CHART数据以及MSL3的ChIP-seq数据相比，信号、peak以及位置十分一致（下图d, e, f）。

对染色质富集的RNA进行分类（local, cis, trans）显示，不同细胞系中绝大多数RNA属于local（编码基因的±10 Kb区域）和cis互作类型（极个别ncRNA除外），下图g, h, i，分别是人MDA-MB-231，mESCs和Drosophila S2细胞。

上述分析表明GRID-seq能发现已知的特异RNA-染色质相互作用，并具有高特异性、高敏感性的特点。

细胞类型特异的相互作用

对人MDA-MB-231和人MM.1S细胞进行比较分析，以探讨富集染色质的RNA是否是细胞类型特异性。

对两种细胞系的染色质RNA进行整体比较，发现大量RNA是两种细胞系特有的（下图b）。

尽管检测到一些common的染色质RNA，但这些common RNA显示出不同的交互模式（热图颜色表示交互强度高低）（下图d）。

此外，除了未注释的DNA元件，RNA互作都以细胞类型特异的方式富集于活性启动子和增强子，许多共有的捕获RNA，在两种细胞中有着相似的染色质互作丰度，与不同的增强子有关系。

超级增强子上的RNA

上述研究发现，RNA会作用于活性增强子。那么GRID-seq信号能否反映普通增强子（typical enhancer，TE ）和超级增强子（super ehancer, SE）的强度差异？

作者以染色质RNA互作水平为标准，对活性增强子进行排序，发现top 10%的邻近增强子的基因活性比bottom 10%强（下图c）。这些与RNA高度关联的增强子，正是MM.1S细胞中的超级增强子。

不同类型的远距离元件上S2细胞特异的RNA交互水平也证实H3K27ac修饰的增强子和染色质富集RNA具有较强的关联（下图f）。下图中REDfly是增强子数据库。

上述研究说明，活性增强子与染色质富集RNA有较强的关系，可以借助活性增强子来鉴定染色质富集的RNA。

RNA-染色质相互作用与TAD

在细胞核的三维空间中，不同的DNA分子是如何相互作用的，Hi-C和ChIA-PET技术可用于研究这个问题。但是，Hi-C或RNAPII  ChIA-PET难以区分活性转录基因和非活性或转录上静止的基因。Hi-C检测的是全部类型的 DNA-DNA相互作用，而GRID-seq捕获的是只生成RNA的基因与DNA元件的相互作用。选取了Hi-C单个基因的部分与GRID-seq的数据作比较。

对mESC细胞系RNA交互和HiC交互情况进行横向比较（下图b,c），并在整体上对交互水平进行Pearson’s Correlation Coefficient（PCC）计算（下图d）。

mESC样本表明，GRID-seq和Hi-C的Pearson相关系数表明它们有着高度一致性。进一步对TAD内部的信号和交互情况进行了探讨，同样呈现高度的一致性和相关性。

上述研究表明，染色质与RNA的相互作用主要存在于细胞核的高级结构中，GRID-seq技术可应用于预测与RNA生成有关的基因组相互作用，可作为现有的3D genome研究的补充。

启动子与增强子的联系

基于Hi-C、GRID-seq数据，作者进一步深入研究转录相关的基因组相互作用，来探讨一个长期未能解决的问题，即3D genome中增强子和活性启动子如何相互作用？

作者首先鉴定出启动子-启动子和启动子-增强子的互作结果，并使用Cytoscape进行可视化（下图a）。每个启动子关联的RNA最多可达4个，表明一个基因的启动子可能作为其他基因的增强子。每个富集染色质的RNA能与多种typical增强子相互作用，但只和1-2个超级增强子发生相互作用。相反，无论普通或者超级增强子，大部分都与一个或两个基因来源的RNA相互作用。

最后，利用GRID-seq和Cytoscape软件绘制全基因组相互作用网络，展示了单个染色体的结构（下图g）。

上述结果表明，在很多增强子控制一个基因的同时，每个增强子无论是普通还是超级增强子，调控着一系列高度特异的靶基因。尽管检测到的染色体间的启动子-启动子互作很少，但是的确观察到了染色体间的特异互作。

接下来，需要进一步验证这些预测到的染色体间的相互作用（特别是在单细胞水平），有助于进一步了解细胞核3D空间的基因组结构。

总    结

作者通过设计一种特殊的linker来连接RNA和DNA，从而实现了全基因组范围内的RNA-DNA相互作用的检测和分析。

本研究，利用人、小鼠和果蝇细胞的GRID-seq数据对RNA-DNA相互作用模式进行较为详尽的阐述，同时与Hi-C等数据进行了比较，另外对染色质富集RNA的分布特征进行了探讨。

越来越多的研究表明，新生RNA和非编码RNA都参与了染色质上一系列的调控过程，如：通过招募RNA依赖的DNA甲基转移酶、转录激活剂或抑制剂进行表达调控。

总而言之，GRID-seq技术的建立和发展，有助于科学研究者发现更多RNA介导的调控活动。

参考文献

1. Lieberman-Aiden E, Van Berkum N L, Williams L, et al.  Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding  principles of the human genome. SCIENCE, 2009.

2. Kudla  G, Granneman S, Hahn D, et al. Cross-linking, ligation, and sequencing  of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. PNAS, 2011.

3. Xiao Li, Bing Zhou, Liang Chen, et al. GRID-seq reveals the global RNA–chromatin interactome. Nature Biotechnology, 2017.

良心补充，快来获取代码和数据集

本文GRID-seq相关数据集和代码可以参考UCSD页面：http://fugenome.ucsd.edu/gridseq/

该页面存放了主要的分析脚本和样本数据集信息，具体脚本不再讨论：

• GRID-seq Pipeline

  1.Raw data processing script: gridseqMain.sh

2.Enhancer-promoter interaction: gridseqSubnet.sh

3.Sub-function script: gridRsub.getGeneHitCutoff.R

• GRID-seq peaks of chromatin-enriched RNAs (BedGraph)

1.human MDA-MB-231: gridseq.MDA231.bdg.tar.gz

2.human MM.1S: gridseq.MM1S.bdg.tar.gz

3.mouse mESC:  gridseq.mESC.bdg.tar.gz

4.Drosophila S2: gridseq.S2.bdg.tar.gz

• GRID-seq raw data (fastq) and processed datasets are accessible at GEO: GSE82312     

• GRID-seq raw data (fastq) are also accessible at SRA: SRP076189 with detail information as below:

作者：马可菠萝

审稿：童蒙

编辑：angelica

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