【BioArt快讯】清华杨茂君课题组Cell发表突破性研究成果
北京时间12月2日凌晨，国际学术期刊Cell在线发表了清华大学杨茂君课题组题为《哺乳动物呼吸链超级复合物I1III2IV1结构》（Structure of mammalian respiratory supercomplex I1III2IV1）的研究论文，首次获得了猪心呼吸链超级复合物4.0 Å分辨率下的冷冻电镜结构，其中复合物Ⅰ和复合物III更是达到了原子分辨率（3.6 Å）。
论文解读
撰文丨Andy
有氧呼吸是动物和植物进行呼吸作用的主要形式，指的是细胞在氧的参与下，通过多种酶的催化作用将糖类等有机物彻底氧化分解，产生出二氧化碳和水，同时释放大量能量的过程。细胞内的能量物质转换发生在线粒体中，因此线粒体是为细胞提供能量的“动力工厂”。其氧化过程由线粒体内膜上的4个呼吸链膜蛋白复合物(简称复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和IV)来完成。在多种低等生物中，多亚基的复合物Ⅰ可被一类单一组分的Ⅱ型NADH氧化还原酶型（NDH2）所替代。NDH2以FAD为辅基，催化电子由NADH传递到辅酶Q，完成了电子传递链的第一步反应。
线粒体复合物结构生物学的研究有助于彻底阐释这些复合物的电子传递机制以及跨膜质子泵的工作原理，并可为细胞呼吸相关的疾病（如老年痴呆症、帕金森综合征和多发性硬化症等）的治疗提供重要的靶位信息。因此，线粒体复合物的结构一直是结构生物学研究领域研究的焦点。
线粒体复合物结构生物学领域的重要进展出现在1995年，Tsukihara等首次获得了牛心复合物IV晶体的衍射数据，电子密度图清楚地显示了各个金属结合中心【1】（同年，Iwata等在Science上发表了脱氮副球菌复合物IV部分亚基的晶体结构【2】）。一年后，Tsukihara等报道了基于这套数据解析的牛心线粒体复合物IV完整的13亚基的晶体结构【3】。基于晶体结构，研究人员阐明了复合物IV内部的电子传递路线。
1997年，Xia等在Science上首先报道了牛心线粒体复合物Ⅲ的在2.9 Å分辨率下的部分结构【4】。1998年Iwata等确定了牛心线粒体复合物Ⅲ11个亚基的完整晶体结构【5】。基于这一重要结构以及来自于Zhang等【6】的重要贡献，线粒体复合物Ⅲ内部的电子传递机制得以阐明。
2005年，饶子和院士课题组的孙飞等在世界上首次报道了由四种不同蛋白质组成的复杂的猪心线粒体复合物Ⅱ的精细三维结构【7】。该复合物尾部分布了5个带电的氨基酸和两个极性的氨基酸，由此确定了复合物Ⅱ是一个跨膜蛋白质复合物，而不是一个外周膜蛋白。同时进一步验证了电子传递体的氧化还原电位是受其周围的氨基酸环境调控的。这是线粒体呼吸链研究领域中一个里程碑式的发现，填补了线粒体结构生物学和细胞生物学领域中的一个空白。这一研究成果发表在Cell上，是Cell 1980年来首次完整地刊登中国科学家在本土完成的完整系统原创性研究成果（Cell杂志主编在刚过去的世界生命科学大会的报告中特地展示了这篇文章，可见这篇文章的意义确实非同一般，见下图）。这一研究成果还被写入翟中和院士等主编的《细胞生物学》等教科书中。需要指出的是，复合物Ⅱ的原核版本是在 2003年被 Yankovskaya 等解析的，结果发表在Science上【8】。
2010年，Hunte等首次确定了由40多个不同的蛋白质组成的酵母线粒体复合物Ⅰ较低分辨率的晶体结构（6.3 Å）。2015年，同一课题组（Brandt）又将分辨率提高到了3.9Å。对于细菌呼吸链复合物Ⅰ来说，Sazanov等在2006年解析了8亚基的嗜热菌复合物Ⅰ的亲水结构域【11】。独立后的Sazanov领导的研究组先后报道了嗜热菌的完整复合物Ⅰ较低分辨率的晶体结构（4.5 Å）【12】、大肠杆菌复合物Ⅰ跨膜结构域3.0 Å的晶体结构（缺NuoH）【13】和嗜热菌复合物I较高分辨率的真正完整的晶体结构（3.3 Å）【14】，至此终于阐明了这一已知最大膜蛋白复合物的整体结构和作用机制。
理论上，生物大分子的结构解析主要有X-射线衍射、核磁共振和冷冻电镜三种技术手段。而实际上，冷冻电镜的分辨率在相当长的一段时间内一直无法与X射线晶体学相提并论，甚至一度被嘲笑为“blob-ology”。但是近几年，冷冻电镜领域取得了革命性突破，一个原因是直接电子探测器的发明和应用，另一个是高分辨率图像处理算法的改进（Relion程序），使得单颗粒冷冻电镜现在可以较为轻松地解析300kDa以上的非对称性蛋白复合物近原子或原子分辨率的结构，用这种方法获得的最高分辨率已经达到了惊人的1.8Å，分子量亦达到了93kDa。毫无疑问，冷冻电镜正在超越其它一切技术手段，越来越成为大多数结构生物学家们的第一选择。
2016年8月10日，Zhu等在Nature上在线发表了牛线粒体复合物I 4.2Å的冷冻电镜结构【15】；9月5月，Sazanov课题组的Fiedorczuk等在Nature上在线发表了完整绵阳线粒体复合物I 3.9Å【16】的冷冻电镜结构。这两个哺乳动物线粒体复合物I的结构（特别是后者）为该复合物的作用机制、组装、成熟和功能失调提供了重要间接，允许对引起疾病的突变进行详细的分子层面上的分析。
杨茂君课题组早在2012年就解析了首次II-型线粒体复合物I NDH2家族成员的典型代表——酿酒酵母Ndi1处于无底物、NADH结合状态、泛醌（UQ）结合状态和NADH-泛醌（NADH-UQ）结合状态四种状态下的晶体结构【17】，全面揭示了Ndi1的调控及其介导电子传递的详细机制，并为针对NDH2的药物设计以及更好地将Ndi1应用于基因治疗奠定了良好的基础。
2000年，研究人员发现线粒体复合物并不是完全独立存在的，而是相互结合形成更高级的组织形式——呼吸链超级复合物【18】。后续的研究发现，单独的呼吸链复合物之间通过不同的组合方式相互结合，可以形成多种类型的超级复合物，其中具有完整呼吸活性的超级复合物又被称作呼吸体。哺乳动物中丰度最高、最为重要的呼吸体是由1个复合物I，1个复合物III的二聚体和1个复合物IV组成的，即I1III2IV1。
2016年9月21日，杨茂君课题组在Nature上在线发表了猪心呼吸体的冷冻电镜结构（5.4 Å），该结构为哺乳动物呼吸链复合物在线粒体上的精确的组织形式和分子机理的阐释提供了重要的信息。这一结构也是迄今为止世界上所解析的最大也是最复杂的不对称性膜蛋白超级复合物。同一天， Sazanov 课题组也在Nature上在线发表了绵羊线粒体呼吸链超级复合物的低分辨率的电镜结构【19】。 鉴于分辨率的限制，超级复合物的精确的组织形式在很大程度上仍然未知，进而使得各电子在呼吸链复合物之间的传递详情仍不是很确定。
在这一最新的 Cell 文章中，杨茂君课题组在前期工作的基础上，进一步将分辨率提高到了近原子分辨率的 4.0 Å。结构显示，复合物 III 二聚体和复合物 IV 结合在 L-形复合物 I的同一侧。 四个复合物 I 的附属亚基——NDUFA11， NDUFB4， NDUFB8 和 NDUFB9 直接贡献了复合物 I、 III 和 IV 的寡聚形式。复合物 IV 的 COX7C 和 COX7A 亚基将复合物 IV附着到复合物 III 和复合物 I 膜臂远端形成的凹面处，值得注意的是磷脂分子接到了超级复合物的排列。 之前的 Q 模型指出 UQ 和 UQH2 可以分别结合到 Qi和 Qo位点，并且一个循环只能是一个 UQH2 的电子能被传递到细胞色素 C。该结构更倾向于支持另一个电子传递模型，在这个模型中，从复合物 I 中扩散出来的 UQH2仅仅能结合到 Qi位点，并可以一次将两个电子传递给两个细胞色素 C 蛋白。这一近原子分辨率的结构确定了呼吸链超级复合物的精确的组织形式，揭示了蛋白蛋白和蛋白辅因子之间精致的相互作用，指出了一个电子从NADH 传递到细胞色素 C 的可能的机制， 为整体上深度理解氧化磷酸化系统铺平了道路，同时也为治疗细胞呼吸相关的疾病奠定了重要的结构基础。这一哺乳动物线粒体呼吸链超级复合物结构的解析无疑是当今结构生物学发展历史上的一个重要里程碑。
参考文献：
1.Tsukihara T, et al. (1995) Structures of metal sites of oxidized bovine heart cytochromec oxidase at 2.8 A. Science 269(5227):1069-1074.
2.Iwata S, Ostermeier C, Ludwig B, & Michel H (1995) Structure at 2.8 A resolutionof cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature376(6542):660-669.
3.Tsukihara T, et al. (1996) The whole structure of the 13-subunit oxidized cytochrome coxidase at 2.8 A. Science 272(5265):1136-1144.
4.Xia D, et al. (1997) Crystal structure of the cytochrome bc1 complex from bovineheart mitochondria. Science 277(5322):60-66.
5.Iwata S, et al. (1998) Complete structure of the 11-subunit bovine mitochondrialcytochrome bc1 complex. Science 281(5373):64-71.
6.Zhang Z, et al. (1998) Electron transfer by domain movement in cytochrome bc1. Nature392(6677):677-684.
7.Sun F, et al. (2005) Crystal structure of mitochondrial respiratory membraneprotein complex II. Cell 121(7):1043-1057.
8.Yankovskaya V, et al. (2003) Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygenspecies generation. Science 299(5607):700-704.
9.Hunte C, Zickermann V, & Brandt U (2010) Functional modules and structural basisof conformational coupling in mitochondrial complex I. Science329(5990):448-451.
10.Zickermann V, et al. (2015) Structural biology. Mechanistic insight from the crystalstructure of mitochondrial complex I. Science 347(6217):44-49.
11.Sazanov LA & Hinchliffe P (2006) Structure of the hydrophilic domain of respiratorycomplex I from Thermus thermophilus. Science 311(5766):1430-1436.
12.Efremov RG, Baradaran R, & Sazanov LA (2010) The architecture of respiratorycomplex I. Nature 465(7297):441-445.
13.Efremov RG & Sazanov LA (2011) Structure of the membrane domain of respiratorycomplex I. Nature 476(7361):414-420.
14.Baradaran R, Berrisford JM, Minhas GS, & Sazanov LA (2013) Crystal structure of theentire respiratory complex I. Nature 494(7438):443-448.
15.Zhu J, Vinothkumar KR, & Hirst J (2016) Structure of mammalian respiratorycomplex I. Nature 536(7616):354-358.
16.Fiedorczuk K, et al. (2016) Atomic structure of the entire mammalian mitochondrial complexI. Nature 538(7625):406-410.
17.Feng Y, et al. (2012) Structural insight into the type-II mitochondrial NADHdehydrogenases. Nature 491(7424):478-482.
18.Schagger H & Pfeiffer K (2000) Supercomplexes in the respiratory chains of yeast andmammalian mitochondria. The EMBO journal 19(8):1777-1783.
19.Letts JA, Fiedorczuk K, & Sazanov LA (2016) The architecture of respiratorysupercomplexes. Nature 537(7622):644-648.
杨茂君教授简介
杨茂君，1975年出生于山东省泰安市；1999年毕业于吉林大学生命科学学院，并于2003年于中国协和医科大学获博士学位师（从师从王琳芳院士，2001年10月进入清华大学饶子和院士实验室从事SARS蛋白酶晶体结构方面的研究），后加入美国西南医学中心从事博士后研究。2008年特聘为清华大学生命科学学院特别研究员、博士生导师；2011年受聘为清华-北大生命科学联合中心研究员；2013年通过tenure track 系列考核，成为清华大学首批tenure 系列终身教授。在攻读博士学位期间发表第一作者论文6篇，并于2003年非典肆虐的时候首次解析了SARS主要蛋白酶及其与抑制剂复合物的晶体结构，为抗SARS药物的研发奠定了重要的结构基础。在美国从事博士后研究期间，在Cell、Molecular Cell和NSMB等杂志上发表细胞周期检查点调控相关的第一作者论文6篇。回国以来，杨茂君教授一直致力于综合运用结构生物学、生化与分子生物学等方法，研究与人类健康密切相关的重大疾病的发病机理及特异性抑制剂的筛选与设计，在细胞感应外界信号以及物质跨膜转运、蛋白质翻译后修饰调控两方面取得了一系列重大研究成果，已先后在Nature、Science、Molecula Cell、Genes &Development、PNAS和Cell research等国际权威期刊发表SCI通讯作者论文21篇。此外，杨茂君教授曾获得多项荣誉与奖励，包括霍英东基础研究奖励、教育部新世纪优秀人才支持计划、茅以升北京青年科技奖、药明康德生命化学研究奖、谈家桢生命科学创新奖和国家杰出青年基金等。人才培养方面，实验室培养的所有博士研究生毕业时均获得了清华大学或清华-北大生命联合中心优秀毕业生。其中第一个博士生毕业后被直接特聘为北京化工大学副教授；三人次获得北京市优秀毕业生称号；六人次获得国家奖学金奖励。
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