糖科学，是生命科学领域最后的一片“处女地”。糖科学领域的进展与突破，有望引领全球生物医药研究的范式变革。近年来，美、欧、日等发达国家和地区正在加紧强化该领域的顶层设计和布局，相继启动了一系列大型研究计划。糖研究领域在国内同样受到重视，并已拥有较为完整的研究体系、技术积累和人才储备，基本与国外处于同一起跑线水平，在个别领域甚至处于世界领先位置。北京大学教授，便是糖研究领域的重要一员。此前，三七多糖的合成还停留在 5 糖水平，而在最近他和团队将上述纪录从 5 糖推进至 140 糖的水平，让中药来源的天然植物多糖分子合成迎来了新的里程碑，也是迄今为止最大、最复杂的人工合成植物多糖。假如把多糖的合成比作建高楼，一个糖单元代表一层楼，那么一幢高达 140 层的摩天大楼的建造，它的难度显然是不言而喻的。另一方面，本次工作对于发现抗癌新化合物也有着重要意义。通过合成完整多糖、及其片段，并结合生物活性的评价，课题组对多糖的结构与生物活性之间的关系进行了探索。凭借此，他们鉴定了可能的多糖核心结构域，发现了一个具有抗胰腺癌活性的 10 糖化合物，它对于三种胰腺癌细胞都能起到显著抑制活性的作用，因此有望进一步开发成为抗胰腺癌药物，从而为糖类药物研究开拓新的空间。而且，这种 10 糖化合物的细胞毒性，要远远小于目前治疗胰腺癌的一线药物吉西他滨。因此，这个化合物很有希望对抗胰腺癌的苗头。目前，课题组已经申请相关专利进行保护。他们希望通过进一步的开发，再经过临床前和临床上的进一步试验，最终造出一款抗胰腺癌新药。据介绍，多糖通常与蛋白质、核酸一起被看作是维持生命系统基本活动的三类生物大分子之一，在生命过程中扮演着重要角色。与核酸和蛋白质的研究相比，多糖的研究发展比较缓慢，主要原因是因为多糖的合成不是由基因直接编码，它没有固定可循的合成模板，所以它无法像核酸及蛋白质那样可以被高效快速地制备。截至目前，多糖主要从动物、植物、微生物中分离提取而来。但是，从分子水平上来看，这些天然来源的多糖往往是混合物，不是结构明确的单一化合物，存在结构不均一的缺点。这样一来，就没有办法在分子水平上理解多糖发挥生物学功能的机制。因此，通过合成手段获得结构明确的多糖化合物，是研究多糖结构和功能关系的首要前提。三七作为一种传统中药材，具有多种药用价值。中药多糖的研究也是具有中国特色的一项科研工作。此前，中国科学院上海药物所团队曾从三七中分离出一种多糖成分，并将它命名为 RN1，后在小鼠实验模型上证明它具有显著的抗胰腺癌活性。但是，三七多糖 RN1 的含量有限、分离纯化过程繁琐、提取效率也比较低下，很难通过此前的提取方式，来获得结构明确且均一的三七多糖 RN1。几年前，团队曾发展出一种一釜寡糖合成策略，该策略的全称叫做“糖基供体预活化”。其表示：“我认为有可能通过这种糖合成策略，高效地制备三七多糖 RN1，从而较好地解决三七多糖的获得性难题。”原因在于：RN1 分子具有高度分枝化的结构，它由 140 个单糖单元组成，包含 28 条支链，分子尺寸庞大。因此，要想实现 RN1 分子的化学全合成，将面临着极大的挑战。因此在本次研究之中，课题组从市售的 L-阿拉伯糖和 D-半乳糖这两种单糖出发，制备了多个阿拉伯糖和半乳糖硫苷单糖和二糖砌块。随后，他们充分利用基于糖基供体预活化的一釜合成策略，通过对糖基化反应活化剂种类、反应溶剂、反应温度、时间等因素进行筛选，成功实现了 5 糖、10 糖、30 糖、40 糖、100 糖、140 糖骨架的一釜多组分高效组装，最终在脱除所有保护基之后，实现了三七多糖 RN1 分子的全合成。除了实现完整分子的全合成之外，他们还构建了 RN1 分子的片段化合物库，其中包括三种 5 糖、两种 10 糖、30 糖、40 糖、70 糖共计八个聚糖分子。针对合成糖库中的所有分子、以及所合成的 RN1 完整分子，他们进行了抗胰腺癌活性评价，结果发现其中一种 10 糖对于胰腺癌细胞株（Aspc-1、Bxpc-3 和 Panc-1），有着较为显著的增殖抑制作用，其抑制效果可以与目前临床上常用的抗胰腺癌化疗药物吉西他滨相比拟。鉴于 Panc-1 细胞对吉西他滨存在耐受性，但是对本次合成的 10 糖化合物较为敏感，因此他们进一步探究 10 糖化合物针对 Panc-1 细胞发挥作用的机制。体外机制探索实验结果显示：10 糖化合物通过阻滞 Panc-1 细胞周期，使其停滞于 S 期，从而促进了胰腺癌细胞的凋亡。总的来说，本次工作在复杂多糖合成上具有重要意义。之前，人们虽然也知道多糖很重要，但苦于得不到结构均一的多糖物质。因此，对于三七多糖 RN1 的成功合成来说，它充分彰显了基于糖基供体预活化的一釜糖基化反应策略在多糖合成上的优越性。合成 RN1 的完整分子和重要片段，并对其构效关系加以研究，是一件“开先河”的难事。这是因为，在几年前几乎没有关于合成复杂多糖的工作。在这一细分领域内，仅有课题组在 2017 年发表的一篇论文。在那篇论文之中，他们合成了结核分枝杆菌细胞壁阿拉伯半乳聚糖 92 糖。以此作为参考，他们决定开展本次新课题。2018 年 12 月，课题正式启动，由当时的一年级直博生秦贤进具体负责。首先，他们需要实现单糖砌块的较大规模制备。这就需要设计并合成一系列单糖砌块，因为后续糖苷键的构建都是以这些单糖砌块作为基本原料，所以单糖砌块的量需求较大。其中有多个单糖砌块的量在百克左右。另外，大概有 10 个左右的单糖砌块，平均每个单糖砌块的合成约需 6-9 步反应。然后，他们开始制备寡糖砌块、以及合成两种 10 糖重复片段。在单糖砌块制备完成之后，课题组开始着手寡糖砌块的合成。在多糖合成过程中，他们尽量将难度大、收率较低的糖苷键的构建，在寡糖砌块水平上完成。在大约一年的时间中，他们完成了从单糖砌块、到寡糖砌块的制备、再到两种 10 糖片段的一釜高效组装。接着，他们开始进行糖大片段的拼接。多糖片段的偶联、以及大片段的拼接，是整个课题中难度最大的部分。多糖合成之所以难，主要在于随着分子尺寸的增大，片段之间的偶联效率会显著降低。如果连续两步糖基化偶联的效率都低于 50%，也就意味着本次课题无法继续推进。于是，他们花费大量时间进行偶联反应条件的筛选，依次完成了 30 糖、40 糖、100 糖以及 140 糖的高效合成。此外，多糖的分离纯化及结构表征，是另一块“难啃的骨头”。期间，他们通过不断优化分离方法、以及优化各种检测分析表征手段，实现了大片段多糖的合成和结构表征。接着，他们开始构建三七多糖片段的化合物库。为了探索相关的构效关系，除了合成三七多糖 RN1 的完整分子之外，还需要构建三七多糖片段化合物库。这其中包含八个聚糖片段，为了实现高效的组装，课题组采用了基于糖基供体预活化的策略。最后，针对所合成的九个聚糖化合物，他们开展了生物活性评价。主要评价所合成的三七多糖对于三种胰腺癌细胞系的增值抑制活性，通过此他们发现了先导寡糖结构，并证实这一结构具有抗胰腺癌活性。最终，相关论文以《中药三七中高度分枝的阿拉伯半乳聚糖多达 140 糖的合成及其抗胰腺癌活性》（）为题发在 Nature Synthesis[1]。图 | 相关论文（来源：Nature Synthesis）通过该团队已经发表的论文，他们构建了三七多糖片段化合物库，但是库中的化合物数目比较有限。尽管发现了一个活性良好的 10 糖化合物，但是是否存在活性更好的寡糖片段？对于这一问题，他们会继续丰富三七多糖片段化合物库，以便查看能否发现活性更佳的寡糖。假如可以获得高活性分子，他们将针对动物模型的体内活性进行评价。如果活性不错课题组将深入研究发挥抗胰腺癌作用的机制，并将与药企合作研发创新药物。最终，希望这一系列围绕三七多糖的成果，能够催生新的抗癌药物，从而为中药多糖的现代化研究开辟路径。另据悉，曾获得张天民糖类药物突出贡献奖。对此，他表示：“我们团队一直在糖化学、糖类药物和糖化学生物学领域开展研究。为了解决制约糖科学和糖类药物发展的瓶颈问题——糖类化合物的获得性问题，我们发展了基于糖基供体预活化的一釜寡糖合成策略。”后来，这一策略被全球糖化学界视为寡糖化学合成的重要策略，并得到广泛的应用。以此为核心，课题组发展了一系列糖基化反应的新方法和新试剂，完成了由 92 个单糖单元组成的结核分枝杆菌细胞壁阿拉伯半乳聚糖的首次全合成，在糖合成领域具有里程碑式意义，并被《化学与工程新闻》评为“2017 年度分子”。在此基础之上，2022 年该团队进一步研制了全球首台新型双模式液相糖自动合成仪原型机，构建了糖类化合物的自动合成平台，合成的多糖尺寸达到 1080 糖，创造了新的世界纪录，为糖类药物的研究提供了技术支撑。此外，他们在糖类化合物的成药性研究上也取得重要进展，即发现了一系列结构新颖的糖类药物先导结构、以及疫苗候选物。“因此，获得张天民糖类药物突出贡献奖，是国内同行对我们工作的认可，更是对我们团队的鼓励。”表示。同时他说道：“我相信在糖科学家共同不懈的努力下，制约糖科学和糖类药物发展的技术瓶颈终将被克服，神秘的糖密码终将被解析，我们一定会迎来糖科学大发展的明天。”参考资料：
1.Qin, X., Xu, C., Liu, M.et al. Synthesis of branched arabinogalactans up to a 140-mer from Panax notoginseng and their anti-pancreatic-cancer activity. Nat. Synth (2023). https://doi.org/10.1038/s44160-023-00428-x
排版：罗以