B村全席 | 金唯智新型技术测通AAV-ITR区域，解决基因疗法痛点

      基因治疗在恶性肿瘤、代谢疾病、感染性疾病、遗传病及罕见病治疗方面有着非常重要的意义。而腺相关病毒基因组(AAV)的反向末端重复序列(ITR)能形成高度稳定的二级结构，利用现有技术很难进行序列验证。为了突破这重障碍，B村客官金唯智创研自主知识产权技术，运用原创的测序方法，清晰地分析这些复杂序列，助力研发人员有效地评估ITR区域的完整性。小二带你来一探究竟~

背景介绍

近年来，基因治疗已经展开了相关临床试验，且对应企业颇受投资者青睐。

图片来源：参考资料[1]

其中，腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一种单链DNA病毒，是外源基因强有力的工具，也是非常有前景的基因治疗方法。

在常用的病毒中，AAV产生最低的免疫应答，即使在野生状态下也不具有致病性，因此被认为是最适合治疗应用的病毒。另一方面，AAV优于慢病毒，因为AAV主要是游离的，而慢病毒则需整合到基因组中。恰恰是这种差异非常重要，因为基因组整合位点的局部染色质结构会影响转基因的表达以及邻近基因的表达。因此，使用AAV进行各种基因传递应用的临床试验目前正在进行中。

AAV组件

AAV由蛋白衣壳（capside）和长度为4.7kb的单链DNA基因组（由开放阅读框Rep和Cap组成）构成，蛋白衣壳由三个亚基组成，分别为VP1，VP2，和VP3。AAV基因组两端为两个“T”型的反向末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。这两个ITR是AAV的DNA自我复制的起点以及触发病毒包装的信号，在病毒的复制和包装过程中起着关键作用，并且参与了病毒基因组在宿主基因组上的整合和逃逸过程。

图1：上为野生型AAV-2基因组图2，下为AAV2的ITR序列的示意图

ITR由两个回文臂(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次。

转染过程中，AAV质粒ITR区域的完整性对重组腺相关病毒(rAAV)的产生至关重要。缺失突变的ITRs会降低完整AAV病毒的产量，增加非目的DNA包装的产生3。然而，在使用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，AAV质粒的ITR区域经常发生突变。研究表明，ITR序列的不同区段缺失，都会对rAAV的产生造成影响。因此，对AAV质粒的ITR序列进行准确的分析将会对rAAV的质控具有重要的意义。

面临挑战

以目前的技术，可以通过限制性内切酶的酶切反应来研究ITR的定位及其完整性。但凝胶电泳的分辨率较低，很难检测到点突变或小缺失。

直接对ITR区域进行测序可以提供足够的分辨率，但是由高GC含量和长的回文序列（>100bp）组成的T型发夹结构会抑制普通Sanger测序试剂盒中的聚合酶链式反应，导致测序失败。

由于二级结构在线性模板中不稳定，所以通过PCR扩增ITR区域，然后对扩增产物进行测序可以得到更好的结果4。然而，这种两步法的测序需要特殊的引物设计和循环设置。并且这种检测方法对于ITR区域的两端的序列要求较高，成功率也不能保证。

解决方案

为了解决这一难题，GENEWIZ开发了一种新型的ITR测序方法，可以改善ITR区域的测序信号并延长读取长度。

为了验证我们的ITR测序方法，将其与标准方法进行比较，我们首先使用BigDye®cycle sequencing kit(Thermo Fisher)对含有AAV2 ITRs的质粒进行测序。不出所料，在ITR发夹结构开始处，测序信号突然下降(图2)，导致测序过早终止。

图2：使用BigDye®cycle sequencing kit对AAV2的ITR区域进行测序

红色下划线标记序列后的碱基“TTGGC”是一个无法成功测序的125 bp ITR发夹结构的开端。

而GENEWIZ的新型AAV-ITR测序方法可以测通ITR发夹结构并且在整个ITR区域没有明显的信号损失，达到了与常规测序反应类似的读取长度(图3)。

图3：使用GENEWIZ AAV-ITR测序法测定AAV2的ITR区域的色谱图

红色下划线的序列表示图2中提到的相同序列。黑框内显示完整的125bp ITR发夹结构。

rAAV质粒中ITR完整性的定性评价

目前，rAAV质粒主要在细菌中扩增。然而，由于细菌中同源重组系统，ITR经常发生重排。细菌繁殖后，rAAV质粒中最常见的突变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(图4)。这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，比野生型ITR更加稳定。在对数百条来自不同细菌细胞系中扩增的rAAV质粒进行测序后，我们发现，GENEWIZ AAV-ITR测序方法可以测通野生型ITR序列(图4和图5A)以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列(图5B)，并且能帮助定性评估ITR区域甚至是被部分截断的ITR区域的完整性。

图4：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图

野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，而缺失突变的ITR是一个103bp的发夹结构，其茎部更长。

图5：利用GENEWIZ AAV-ITR测序方法分析rAAV质粒中ITRs的完整性

A) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定野生型AAV2 的ITR区域的色谱图。C-C’臂和B-B’臂分别用红色和蓝色标出。B) GENEWIZ AAV-ITR测序法对AAV2的缺失突变ITR区域进行色谱分析。测序结果显示B-B’臂出现缺失。C) GENEWIZ AAV-ITR测序法测定缺失突变的AAV2 ITR区域的色谱图。测序结果表明，该质粒是完整ITR和缺失突变ITR的混合物。在155-157bp处的TTT峰与完整的ITR序列一致，其中存在缺少B-B’臂的质粒模板。

GENEWIZ AAV-ITR测序方法的优化

一些rAAV质粒在ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域(图6A)。现有的Sanger测序方法测通同聚物G区域非常困难，GENEWIZ的AAV-ITR测序方法也面临同样的困难。伴随着Poly-G的测序过程，测序信号值也逐渐降低，并导致未测序至ITR发夹结构测序反应就提前终止 (图6B)。目前尚未有合适的方法能解决poly-G区域对ITR发夹结构造成的热力学障碍。但是，GENEWIZ的AAV-ITR测序方法能通过反向测通ITR发夹结构和poly-C重复区域(图6A)，进而提高该区域的数据质量及读取长度(图6C)。

图6：GENEWIZ的AAV-ITR测序法对含有poly-G序列的AAV质粒进行测序

 A) ITR区域的5’端前部含有一个同聚物G区域的示意图；黑色和绿色箭头分别表示正向测序和反向测序。B)采用GENEWIZ的AAV-ITR测序法，正向对同聚物G + ITR区域进行测序的色谱图。C)采用GENEWIZ的AAV-ITR测序法，反向对同聚物G + ITR区域进行测序的色谱图。

GENEWIZ的AAV-ITR测序方法能有效评估AAV质粒中ITR区域的完整性。它可以迅速准确地检测到ITR区域的突变，为下游故障的排除节省时间和精力。这种ITR区域的测序方法也将广泛应用于热力学稳定的发夹结构的测序。

金唯智美国客户反馈

此外，GENEWIZ即将推出AAV-ITR测序完成后的构建及修复，敬请期待！

参考资料：

[1] Sakshi Vats, Bhavik Rathod.Gene Therapy for Parkinson’s Disease. International Journal of Scientific & Engineering Research, Volume 7, Issue 9, September-2016   

[2] Berns K I , Daya S . Gene therapy using adeno-associatedvirus vectors.[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2008, 21(4):583.

[3] Savy A. et al.,Impact of inverted terminal repeat integrity on rAAV8 production using thebaculovirus/Sf9 cells system. Hum. Gene Ther. Methods. 2017:28(5):277-289.

[4] Kieleczawa J.Fundamentals of sequencing of difficult templates--an overview. J Biomol. Tech.2006:17(3)207-17.

客官们，小二的宠粉活动开奖啦！截止昨天已经诞生了第10800号、10900号、11000号幸运粉丝！中奖的幸运鹅们，请速速来领奖哦~

（请上面截图的小可爱们留言给小二联系方式，方便领奖哦~）

往期精选▼