间充质干细胞治疗（二）：先进制造工艺
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----步步先生
“工欲善其事，必先利其器”，我们浅谈一下间充质干细胞的生产工艺。
撰文：步步先生
来源：干细胞者说
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书接上回，上一期我们简述了间充质干细胞的研发历程，从国际视野角度介绍了全球间充质干细胞药物研发现状，指出了干细胞药物开发面临的困难。
间充质干细胞治疗（一）：国际视野如果要开发一种“现货型”异体间充质干细胞疗法，规模化生产是阻碍其成药的一个重要因素。本期，我们将浅谈一下间充质干细胞的生产工艺。1
间充质干细胞产品开发的起点
1976年，Freidenstein 等[1]首次发现在骨髓里存在一群非造血的骨髓基质细胞，呈克隆性贴壁生长，形态和成纤维细胞相似。最初被定义为成纤维细胞集落形成单位，之后更名为间充质干/基质细胞 （Mesenchymal Stem/Stromal cell，MSCs）。如今，MSCs 已从人类许多其他来源组织中分离和鉴定出来，广泛分布于几乎所有组织（包括胎儿和成人），例如骨髓、血液、脐带、脐血、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、经血等等。2006年[2]，国际细胞治疗协会（ISCT）给出了人源MSCs最基本定义：[1] MSCs在标准培养条件下，呈贴壁生长；
[2] MSCs表达CD105、CD73和CD90，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记；
[3] MSCs在体外可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞
目前，国际获批上市的 MSCs 产品近10种。随着大家对 MSCs 治疗效果的逐步认可和观点的逐步改变，在不久的将来，将可能有更多 MSCs 产品将获批。有一篇报告[3]描述，细胞产品大概分三种剂量：低剂量（2X10*6 /剂），中剂量（1X10*8 /剂）、高剂量（1.5X10*9 /剂）。目前，临床使用的 MSCs 种类各不相同，来源于不同组织（包括骨髓、脐带、胎盘、脂肪等）。虽然不同组织来源的 MSCs 均能符合国际细胞治疗协会（ISCT）制定的最低标准，但依然有不少研究的结果提示不同组织来源的MSCs 具有某些差异性（比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量，免疫抑制能力也不尽相同）。
图1：MSCs来源于不同组织[4]
面对不同的适应症，我们可能会采用不同组织来源的 MSCs 产品进行治疗。然而，采用不同的细胞分离技术，获得的细胞质量可能千差万别（比如脐带血、骨髓来源的MSCs主要是密度梯度离心法，脂肪和脐带来源的MSCs主要靠酶消化法）。因此，选择合适的分离技术是获得相对可靠、安全、高质量初代 MSCs 的关键。如何选择合适的 MSCs 生产制造工艺，主要取决于两点：一是细胞剂量的要求，二是自体还是异体使用。2
间充质干细胞产品生产工艺
下面，我们从干细胞体外扩增方面，探讨几种间充质干细胞制造工艺。
目前，间充质干细胞制备技术分为两大类，包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。利用自体细胞来源的 MSCs 进行个体化治疗，属于小规模生产，各自企业的标准和工艺也不尽相同。异体细胞来源的 MSCs 规模化制造工艺是利用生物反应器，模拟其在体内的生长发育环境，进行高效率增殖。同时，可以满足自动化、量产并能保证细胞的高活率和高质量的要求，这也是今后各种干细胞规模化生产的发展趋势。
平皿制造工艺
中小规模的临床试验通常使用平皿制造工艺，包括多层平皿培养体系，也称“细胞工厂”（大约8-10层平皿，主要有Thermo Scientific、BD和Millipore等品牌），可以扩增出100亿（10*10）个细胞，相对经济有效。
事实上，在 Osiris Therapeutics 公司进行的早期临床试验中[5]就声称，只需一份捐献的骨髓，便可制备多达10000份患者的剂量，用于治疗GVHD。他们的细胞制备，使用的平皿制造工艺。从成本上来看，平皿制备工艺比较经济。但是质控比较麻烦，需要的人工也多，同时也容易引入外来操作风险。
图2：平皿制备工艺简图
比起人工手动操作，自动化平皿制造工艺略有进步，也具有在线监控功能，可以实现封闭式培养。例如，Xpansion Multiplate 便是自动化平皿培养的一种设备，由一堆平板（10-200层）组成，具有可扩展性[6]。据制造商[6]声称，这种200块平板组成的系统一次开机，可生产200亿（2X10*10）个细胞，但生产下游不好处理。如果剂量处于100-1000亿（1-10X10*10）个细胞之间，平皿制备工艺可以满足MSCs的生产需求，但通常需要堆叠40层。这就需要更大的空间和自动处理装置。
平皿制备工艺，无法满足规模化的细胞生产需求（大于300亿，即3X10*10细胞），这时候就需要引进新的工艺体系。比如，下面要介绍的生物反应器制备体系。
生物反应器制造工艺
生物反应器制备工艺，可作为体外培养的平皿制备工艺替代品。生物反应器，通常对细胞最小接种量是有要求的。早期的 MSCs 扩增，通常先是在平皿中手工操作进行，随后再被接种到生物反应器中。简单的搅拌容器，比平皿更有优势，不但具有可扩展性，还可以提供均匀的最低浓度梯度(pH，溶解氧，代谢物)。如果细胞与微载体结合培养时，可在搅拌条件下固定并培养贴壁细胞，这无疑是最有效技术之一。
在这里，介绍两大类生物反应器类型：灌注式生物反应器（包含中空纤维生物反应器 ）与搅拌悬浮式生物反应器。
第一，灌注式生物反应器
灌注式生物反应器，是一种将MSCs附着在固定基质上的系统（如微珠），可连续交换介质，在排出介质的同时引入新鲜介质。灌注生物反应器由几组平行板、中空纤维、固定床和流化床生物反应器组成。
图3：灌注式生物反应器简图
灌注式生物反应器为细胞生长提供了一个连续的表面积，MSCs可单层附着在填充床表面上，但必须在低流速下灌注（通常不超过3X10-4m/s），使细胞剪切力最小，但这也会导致向细胞输送的氧气减少。通过解耦营养和氧灌注的策略，可以限制培养基的流动而不影响氧向细胞的扩散。一般而言，填充床反应器的细胞获得率通常相对较低（18%），产量限制在约1亿（10*8）个细胞。中空纤维生物反应器，也属于灌注式生物反应器的一种。它由一个容器和堆叠的半透性中空纤维组成，可以允许细胞生长在中空纤维毛细管的一个表面，而营养液和氧气在另一个表面流动。其扩增效率大约是平皿制备体系的10倍（按照培养UC-MSCs计算）。
中空纤维生物反应器，每一次运行可生产4~6亿（10^8）数量的MSCs，具有典型的商业特性。如果要开展临床试验需要供应足够的MSCs，那么则需要多个生物反应器才能实现。
因此，灌注式生物反应器配置更适合于自体的规模化生产，而不是异体细胞的规模化生产。
第二，搅拌悬浮式生物反应器搅拌悬浮式生物反应器，主要用于MSCs的大规模生产。以旋转瓶为原型，用搅拌臂将培养基在培养瓶中搅拌混匀。
图4：搅拌悬浮式生物反应器简图
在搅拌悬浮式生物反应器中，MSCs通常附着在悬浮在搅拌容器中的微载体上。这类生物反应器可以产生多达5000亿（50X10*10）个细胞（此类产品有Eppendorf、Thermo Scientific和PALL等品牌，国内华龛生物自主研发的3D FloTrix®vivaSpin 系列也属于此类）。其范围从小体量（3-250ml，适合工艺参数测试）到台式规模（1.5-5L），再到中式规模（50-300L），最后到生产规模（500-2000L）。工艺下游的处理需要连续离心，自动袋或小瓶填充等完成。
微载体
说到搅拌悬浮式生物反应器，这里必须要讲一下微载体（有SoloHill®，CultiSpher®-S，Cytodex®-1等品牌，国内自主研发品牌华龛生物3D TableTrix®）。微载体是干细胞赖以附着生长和扩增的基质。微载体可以用各种材料（聚苯乙烯、纤维素、葡聚糖、玻璃、海藻酸盐和明胶等）制备；可以为无孔，微孔，大孔；可以有表面涂层（胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和多聚赖氨酸等），也可以没有。
简单的说，如果说生物反应器是一个海洋，那微载体就是一个个岛屿，而干细胞就是居住在这些岛屿上的居民。干细胞可以在微载体上的有效扩增和分化，依赖其调节细胞形状和形成组织的能力。由于微载体具有多样性，利用特定微载体的合理设计，可能为规模化细胞制备提供均一稳定的制剂来源。
但微载体缺点也很明显，比如微载体容易聚团，高速旋转产生的剪切应力会对细胞造成损伤，微载体和干细胞的分离也是个难题。
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文末小结
本期内容，我们简单介绍了间充质干细胞的生产工艺，包括平皿制造工艺和生物反应器制造工艺。开发者可以根据 MSCs 细胞药物的自身特性（如自体/异体，剂量，剂型，规模），选择合适的生产工艺。作为细胞产品，必须确保进入临床的每一剂细胞质量都是可靠的。有效的质量控制方法和标准，是干细胞临床安全性和有效性的基础和前提。先进的生产工艺有选择了，那么我们如何能保证细胞产品的质量呢（比如：无菌性，安全性，活力，均一性，纯度，稳定性和效力）。下一期，我们将针对间充质干细胞的质控体系展开论述，敬请期待！主要参考文献：后台索取
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