一份研报：读懂类器官行业
类器官 VS 组织样本 VS 动物模型
目 录
一、类器官的概念
二、类器官的发展历史
三、类器官的培养
四、类器官的应用
五、类器官的产业链
六、类器官的市场格局
七、类器官的挑战
八、类器官的未来发展
-01-
类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。
目前类器官分为两类：组织来源类器官和多能干细胞来源类器官。
相比传统的二维培养模型，类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组、更适合于生物转染和高通量筛选等优势。而与动物模型相比，类器官模型的操作更简单，还能用于研究疾病发生和发展等机理。因而在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。2013年，类器官被《科学》杂志评为年度十大技术。2018年初，类器官被评《自然·方法》评为2017年度方法。
在Pubmed上搜索 “类器官” 这一词条，类器官相关文章从2010年的42篇，在短短十年间，跃升到2020年的2097篇。类器官以极迅猛的态势成为研究热点。
-02-
类器官的起源可以追溯到1907年，当时44岁的美国贝克罗莱那大学教授威尔逊 (H. V. Wilson)发现通过机械分离的海绵 (sponge) 细胞可以重新聚集并自组织成为新的具有正常功能的海绵有机体，他的研究结果于1910年发表。威尔逊的研究证明了成年的有机体在无需外界帮助、无需从特定的解剖学阶段开始，也具有完整的信息并可以成功发育成新的有机体。
对类器官技术而言，另外一个十分关键的契机是干细胞技术的发展。干细胞想必大家并不陌生，很多人对于干细胞的第一印象都是来源于媒体中对于血液疾病造血干细胞移植疗法的介绍。近年来火热的干细胞研究，主要开始于上世纪末。1987年，A. J. Friedenstein发现间充质干细胞 (Mesenchymal Stem Cell, MSCs)。 1998年，美国生物学家James Thomson首次分离得到人胚胎干细胞。2007年，山中伸弥教授成功制造出人诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells, iPSC)。如今，绝大多数类型的非肿瘤来源的人源类器官均可由MSCs或iPSC发育而来，干细胞研究的飞速进展为类器官研究带来新的活力。
当代类器官的发展成果，主要集中在近十余年。
2007年，Hans Clevers 的实验室通过 lineage tracing 验发现小肠和结肠的干细胞为 Lgr5+细胞。 2009年，Hans Clevers实验室使用单个鼠LGR5+肠干细胞在体外自组织成为具有肠隐窝-绒毛结构的肠类器官。 2011年，由人多能干细胞和原代成体干细胞发育而来的肠类器官被成功制作。同年，由鼠胚胎干细胞培育而来的视网膜类器官被首次成功培育。 2012年，由人多能干细胞发育而来的视网膜类器官成功培育。 2013年，由人多能干细胞发育而来的脑类器官被成功培育。肝、肾、胰类器官被成功培育。 2014年，前列腺、肺类器官被成功培育。 2015年，乳腺、输卵管、海马体类器官被成功培育。 2020年，蛇毒液腺类器官被成功培育。
目前3D类器官培养技术已经成功培养出大量具有部分关键生理结构和功能的类组织器官，比如：肾、肝、肺、肠、脑、前列腺、胰腺和视网膜等。
-03-
类器官的培养可以利用体细胞、成体干细胞（包括祖细胞）或多能干细胞。2009年，肠道器官模拟技术率先取得突破，研究人员发现，成人肠道干细胞可以在体外增殖和自发组织化。其特征是能够表达LGR5，这是一种编码Wnt激动剂R-spondin受体的基因，同时需要特定的分子围绕在旁（如Wnt、KGF和noggin）。以此为理论基础，研究人员开发了一种三维培养体系，能够在体外重建肠道干细胞的适宜环境，并从肠道上皮细胞或单个LGR5+干细胞分化出具有自我更新能力、保持肠道腺窝绒毛状结构的类器官。该模型可以持续扩增达3个月，稳定的基因组保证了纯化和生产放大等优势，此后这种方法被用于从其它主要器官上皮组织培养各种类器官。
成人干细胞衍生的类器官培养，通常是通过将分离的成人干细胞或所需器官培养的单细胞悬浮液，嵌入到细胞外基质（ECM）水凝胶中来建立的。例如肠道器官，从小肠或结肠分离出的隐窝细胞足以培养出类器官，也可以从分离的成人肠干细胞中培养出类器官。
上皮类器官培养基是以附加与器官相关的生长因子的培养基为基础的。因此，从其他组织（如呼吸道、肝脏、胰腺、皮肤、膀胱、大脑、心脏）提取的细胞器要求在培养中补充相关生长因子。例如大脑类器官培养过程如下图：诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞在神经诱导介质中生长，产生神经外胚层，嵌入Matrigel中，并在旋转生物反应器或轨道摇床中生长，以更好地扩散，获得三维脑器官。在暴露于维甲酸的情况下，大脑器官通过自我组装模式，形成自缔和组织，形成包括放射状胶质细胞在内的不同种群的神经祖细胞，这些神经祖细胞扩展形成大脑结构。
除了成体干细胞，多能干细胞（包括诱导干细胞和胚胎干细胞）也可以利用其自我更新及分化能力来制备类器官。由于从多能干细胞中提取的类器官是通过同质群体定向分化而形成的，因此，必须在一个唤醒胚胎发生的动态过程中重新创造组织特异性细胞类型及其微环境。因此，多能干细胞类器官培养必须在分化过程中提供合适的生态位信号。由于这一过程较复杂，多能干细胞类器官往往含有不同于模型器官的细胞类型，使靶组织的信号环境和自组织复杂化。
1、科学研究中的类器官培养
1.1 上皮类器官研究上皮细胞-免疫细胞相互作用
上皮细胞出现在机体所有和外界接触的边界，比如皮肤，呼吸道，肺，消化道，是机体对抗病原体侵染的第一层屏障，也是第一个对病原性感染作出反应的细胞。为了维持体内平衡，并提供对感染的快速反应，上皮细胞与免疫细胞密切配合。所以在上皮区域，也是全身免疫细胞浓度最高的区域。建立上皮细胞和免疫细胞相互作用的模型，是研究抗感染免疫和损伤后免疫的重要手段。上皮细胞类器官的建立，可以非常精准的模拟机体上皮环境，也被发展起来研究上皮和免疫细胞相互作用。
有三种共培养的模式
3.在ECM或生长培养基（悬浮培养）中，向完整的类器官中添加（活化的）免疫细胞，如T细胞或固有淋巴样细胞（ILCs），以评估免疫细胞与上皮细胞之间的相互作用。这些检测的读数通常包含消化形成的器官和随后的转录。单细胞RNA测序或定量PCR（QPCR），成像和/或流式细胞术评估上皮细胞和/或免疫细胞表型。在这些共培养中使用的免疫细胞要么直接从小鼠组织（例如，脾细胞、肠上皮内淋巴细胞、固有层T细胞、固有层ILCs或肺ILC2s）中分类，要么直接从人外周血中提取，要么先在体外分化。
1.2 胸腺类器官研究T细胞发育
2、肿瘤微环境
两种主要的方式被使用（以非小细胞肺癌为例）
在整体方法（左）中，肿瘤活检组织是在气液界面间环境培养，所有肿瘤细胞类型的细胞悬液，包括内源性免疫细胞和其他非上皮细胞类型，促进肿瘤特异性T细胞的生长。
在还原模拟方法（右）中，上皮类器官是从肿瘤活检组织中生长出来的，然后与来自同一患者外周血的自体免疫细胞共培养，以促进肿瘤反应细胞的连续扩张。
虽然整体方法允许包括整个肿瘤微环境的肿瘤材料的培养，因此与体内情况非常相似，但不易长时间维持，而还原模拟方法允许肿瘤上皮的长期培养和扩展，这使得更广泛，更长期的研究成为可能。
3、药物筛选
-04-
主要研究模型对比
数据来源：Science杂志
药物筛选流程包括类器官的构建、评估、药敏检测三大方面：
类器官构建：类器官的样本来源通常为肿瘤组织或者胸腹水等恶性积液，主流的培养方法包括较为常用的正置胶滴法、适用于肿瘤和睾丸类器官培养的倒置胶滴法、适用于有气体接触的黏膜类器官（肠、呼吸道）培养的气液界面法以及需要较大扩增（脑类器官）的生物反应器法等。首先将患者来源的肿瘤样本组织通过机械剪切得到肿瘤细胞团，再将细胞团酶消化成单细胞。分离消化后，将细胞嵌入到基质胶中并在96/384孔板上进行胶滴的种接，再覆盖以培养基和细胞因子培养。类器官培养至直径几百微米的细胞小球即可用于药筛。类器官培养特有的重要试剂包括消化液、培养基（例如Wnt、R-Spondin、Noggin等细胞因子）、基质胶（Matrigel等）。
类器官评估：在培养好类器官之后，对于类器官的评估和验证也至关重要。通过基因测序、免疫荧光、HE染色等方法，从形态学、组织病理学以及分子遗传学等多个维度对类器官进行鉴定。评估的目的是确定类器官和原肿瘤具有一致性，这也是进行后续药筛的前提。
药物检测：类器官目前可筛选的药物种类包括化疗药、小分子靶向药、抗体药物等。药筛的核心检测检测指标通常为IC50以及细胞抑制率，根据这些指标在筛查的药物中选取对肿瘤抑制效果最佳的药物。在中国的注册临床中，类器官以化疗药的敏感性检测作为主流应用，类器官用于检测靶向药和免疫治疗的敏感性在未来还有极大的发挥空间和应用潜力。
3.1.3 类器官药筛的发展方向
类器官药筛与二代测序作为组合产品使用，二者在临床上可以有机结合，很好地相辅相成。二代测序从基因层面上检测出患者的靶点突变情况和潜在的药物敏感靶点，为医生和患者提供初步用药选择，但是单凭二代测序结果无法保证完全的临床疗效。部分研究报道和临床案例指出，二代测序筛出的潜在靶向药并没有在实际临床上反应出有效性，这一部分的不确定性通过类器官可以很好排查。
3.2 基因型分析
来自不同健康器官的类器官的生长，然后对培养物进行全基因组测序，可以分析器官特异性突变谱。通过生长来自同一肿瘤不同区域的类器官，可以用于研究肿瘤内异质性。区域特异性突变谱可以通过类器官的全基因组测序来揭示。使用与上述相似的方法，可以利用类器官来研究特定化合物对健康细胞和肿瘤细胞突变谱的影响。
癌症是由致病基因突变的逐渐积累引起的。因此，了解在组织稳态和肿瘤发生过程中活跃的突变过程是很重要的。（资料来源：中君亚泰、干细胞者说）
-05-
类器官行业的上游公司主要集中在为3D细胞培养提供试剂和材料原料，包括提供细胞支架材料、胞外基质、细胞生长因子、培养基和生物反应器等。其中有比较老牌的试剂厂商ThermoFisher，Sigma-Aldrich（现被Merck收购），也有一批取得较大成就的创业型公司。包括瑞士的提供无支架三维细胞培养产品的InSphero公司，加拿大最大的生物科技公司STEMCELL Technologies提供专业的细胞培养基和细胞分选产品，和提供体内微环境模拟系统的美国公司Xcell Biosciences等。
主要的3D细胞培养技术
根据Meticulous Research Analysis的资料显示：2016年，3D组织培养在全球细胞分析检测市场占据了约9.3%的份额。2017年市场价值8.181亿美元，在预计期内将以8.7%的年复合增长率增长，2022年达到12.426亿美元。其中，美国在全球3D细胞市场贡献了约34.8%的主要份额，位居全球首位。2016年，中国在全球3D细胞市场占5%的份额，远不及美国，但预计未来五年中国将以11.8%的年复合增长率增长，成为年复合增长率最高的国家，具备市场发展潜力。
类器官行业的中下游公司营收点主要在于给各大新药测试公司提供药物体外试验方案和疾病模型，即临床试验外包服务。例如哈佛大学Wyss生物工程学院2013年成立的生物技术公司Emulate，Emulate和FDA将合作，评估和鉴定使用Emulate的“器官芯片（Organs-on-Chips）”技术作为毒理学测试的平台的可能性，并先后宣称与阿斯利康和罗氏形成战略合作；荷兰生物技术公司 Mimetas研发了一种芯片肾，并与几家制药公司达成了应用合作协议将其用于药物筛选；上市公司Organovo宣称研发出第一台生物器官的3D打印机，开发出人造肝﹑人造肾。并于2017年10月宣布与Viscient Biosciences达成合作，以进一步研究肝病。
类器官行业尚未在国内形成集中化产业集群。除了传统的国外细胞培养试剂和原料代理商外，中下游的公司较为稀疏。在北京、上海和广州区域先后涌出了几家创业型公司。
类器官行业在欧洲国家发展较为迅速，这和欧洲类器官科研最早起步以及积累最多必不可分。类器官的领头人Hans Clevers成立的Hubrecht Organoid Technology（HUB）是类器官最早的研发中心，HUB技术授权促进了Epistem、Cellesce、Crown Biosciences、STEMCELL Technologies在内的一批类器官公司的涌现。中国在类器官领域中，近年来其实也呈现出科研数量大幅度上升的趋势，尤其在2019-2020年这两年间显现出了强劲的发展势头，发表的文献数量在全球的排名从第六位（2009-2019年）跃至第二位（2020年），仅次于美国。参考欧洲的类器官发展模式，可以预计中国基础科研积累的提升将加速类器官产业化的进程，在不远的将来我们也将看到更多类器官公司的涌现。
-06-
在全球范围内类器官已经显示出其强大的发展潜力，国外已经形成一定的市场竞争格局，多家公司正在快速的发展，例如AIVITA Biomedical、System1 Biosciences、JangoBio等。但国内还未真正形成竞争市场。
数据来源：中君亚泰根据公开资料整理
-07-
类器官培养技术目前正处于技术爆发和科研成果井喷的阶段，行业发展具有很大的前景，但也面临较大的挑战。比如如何利用好人体胚胎的干细胞建立持久稳定的体外模型；培养条件和环境刺激如何更真实的模拟还原人体微环境；科研属性的产品如何实现量产，如何转化为临床产品等。
类器官作为新型的药筛模型，成本虽然较PDX更低，但还是远高于细胞系。类器官成本占比较高的包括培养使用的基质胶，常用的基质胶为美国BD Biosciences公司的Matrigel®，在行业内处于较为垄断的地位，价格较高。Matrigel可以产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，帮助多种类型的细胞达到附着和分化。Matrigel的来源是小鼠肉瘤细胞系，除了成本较高的问题，同时批次间存在一定的变异性。且由于是动物来源，对于有机类的药物的检测有局限性。考虑到小鼠来源的细胞外基质对于药物筛选实验结果存在一定的干扰，因此基质的工程技术开发用于合成外源差异较小的、非动物来源的基质胶用于成本下降和性能优化将是类器官产业化需要解决的关键性问题之一。基质胶以外，培养也涉及多种细胞因子组合使用，细胞生长因子通常也价格不菲。选择效果更好的细胞因子以及尝试减少使用细胞因子的数量也可以带来成本下降的空间。
目前大多类器官本身并不具备血管化的结构。因此，随着类器官体积的增长，类器官受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官，将类器官肿瘤细胞和血管内皮细胞在Matrigel上共同培养，生成血管结构以期解决类器官血管化缺失的问题。
血管化以外的难点还包括模拟肿瘤和免疫环境的相互作用关系。2019年Nature Protocol 期刊发表了肿瘤类器官和免疫细胞共同培养的相关protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征。以上皮类器官和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加ECM中的重组细胞因子等方法重塑类器官和免疫细胞的相互作用。
相比于单个类器官，类器官系统的构建能够对药物疗效和潜在毒性做出更完整全面的评估。目前类器官仅能检测出药物对于肿瘤的抑制效果，对于其他器官组织是否存在其他副作用和安全性风险并不能做出预判。为了解决这一问题，2017年Skardal et al.构建了有心脏、肺部、肝脏组成的集成于闭合循环关注体中的类器官系统，以达到全面揭示药物对不同器官的毒性和药效的目的.
重复性和一致性 也是类器官发展的重大瓶颈，这很大程度上由于过程控制的欠缺与行业标准的空白。类器官培养过程中人为因素的过多参与、自动化程度低导致因为系统偶然性造成的误差较大。同时，类器官检测手段十分匮乏，活体观察主要集中在形态学观察，断点观察集中在基于荧光的各类指标的检测，能够活体实时对类器官各项指标进行检测的光学、电化学等手段仍较为欠缺。当前，类器官很多研究者致力于制造更新的类器官，做出之前未能做出的类器官，我们可以制作海马体、垂体、腺体、脾、肾的类器官，却难以确定一个符合要求的类器官需要满足那些个体的诸如尺寸、形状、基因表达量等，群体的诸如类器官之间的方差等统计学指标。这将限制类器官的高效研究与向临床研究的转化。
对于类器官培养过程中的工程控制也是亟待解决的问题。当前类器官培养大多使用Matrigel水凝胶作为培养基质，Matrigel是康宁生命科学公司生产的Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物。Matrigel因其含有外源成分，难以应用在人的很多治疗场景。另一方面，虽然类器官与微流控技术已有一些结合研究的例子，但使用微流控芯片对类器官生存的流体环境进行模拟仍不成熟，如何使用微流控等技术对类器官培养时流体微环境进行控制是亟待解决的问题。同时，现有类器官的直径约在100-500μm之间，虽然具有一定程度的尺度效应，但还是难以模拟真实组织、器官的场景。倘若要制造尺度更大的类器官，类器官的血管化也是十分重要的问题。
-08-
1、国家政策推动
2021年1月28日，科技部下发的《关于对“十四五”国家重点研发计划6个重点专项2021年度项目申报指南征求意见的通知》中，把“基于类器官的恶性肿瘤疾病模型”列为“十四五”国家重点研发计划中首批启动重点专项任务。另外，“十四五”国家重点研发计划中重点指出，类器官作为一项重大的技术突破被用于疾病模型的建立中，且可用于研究病理状态下干细胞变异、异质性及其发生机理，挖掘疾病诊疗的新靶标，探索诊疗新策略。类器官技术在未来将有非常大的应用价值和发展前景。
传统制备法，是一种依赖于生长因子的3D培养技术，有其局限性（比如对类器官及局部环境的控制不够精确）。此外，传统制备法不能很好地复制器官发展过程中复杂又动态的微环境，而这种微环境恰恰是器官形成的有利因素，这就使得获取更完整的类似体内器官发展的类器官过程困难重重。
目前最前沿的便是，由器官芯片技术与类器组合成的“类器官芯片”技术。类器官不是唯一，多模型的整合才是王道，基于原位组织和动物模型的研究仍将是生物医学研究的金标准。
类器官已经成为一种吸引人、易于从多能干细胞系复制的人体外组织模型，但是，以大脑类器官为例，其与原位细胞类型之间仍存在着很多差异，从而可能会混淆人们对内源性脑功能的认识，并可能提出关于神经病理学的误导性假设，最终可能误导治疗方法。这就需要对原位组织中的每一种细胞特性进行深入的了解和表征，包括通过结合转录组、表观基因组和蛋白质丰度等方法来表征的细胞类型；包括空间组织、形态和物理连接性参数的细胞结构组织；以及包括代谢状态和电生理在内的细胞和组织功能指标。
在今天，类器官尚且无法独当一面，而未来，类器官也不需独当一面，多模型的整合才是研究的最佳方案。展望未来，类器官研究前景巨大。类器官高度仿真的疾病模型有望继续在精准医疗、再生医学等领域取得新的进展。同时，“ 类器官+”，有望给类器官研究带来新的增长点。与活体实时成像技术结合的类器官技术有望让人们第一次实时观察到人早期发育过程；与生物3D打印相结合，有望实现基于类器官的功能性治疗；与“人类细胞图谱 (Human Cell Atlas, HCA)”技术结合，类器官细胞图谱将推进病加速包括罕见遗传病、复杂多因素疾病、精准肿瘤治疗等以疾病为中心的研究。
相关链接
— END —
干细胞者说
- 科普 情怀 责任 -