反相液相色谱系统峰及其形成原因
1概述
在反相液相色谱中，死体积附近往往会形成一个或一些正的或者倒的色谱峰，这些色谱峰独立于样品而存在，可以统称这些色谱峰为系统峰。一般地，系统峰的产生与所使用的色谱柱，流动相添加剂以及起始有机相的比例有关。从经典色谱塔板理论出发，流动相经泵混合经由管路系统引入到色谱柱内，流动相内的所有组分，均会在固-液两相之间分配，直到平衡。而当样品或者其他与起始流动相组成比例不同的溶液被注入色谱柱的时候，色谱柱头部的各物质的分配平衡被干扰，每种物质的平衡状态被干扰之后再次回复到平衡状态的过程中，也就产生了系统峰，检测到的系统峰的种类与多少和采用的检测器的种类有关(如一些盐离子在紫外检测器上无法被检测到，却可以被CAD检测器检测到)。
如下图1所示，流动相为ACN：Water=4：96，添加剂TFA的浓度为0.1%，进样溶剂组成为ACN：Water=4.4：95.6，添加剂TFA的浓度为0.1%。图中的正负色谱峰即为典型的系统峰。
2反相液相色谱系统峰的影响因素
如前所述，反相色谱系统中，系统峰的形成与色谱柱，流动相的组成特别是添加剂的种类以及浓度有关，此外配置样品的溶剂的组成也是十分重要的因素。如下图2A所示，流动相的组成为乙腈与纯水，添加剂为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌，进样溶液为与流动相比例相同的乙腈与纯水；图2B所示，流动相的组成为乙腈与纯水，进样溶液为1：1的1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌溶液。
由上图2A与图2B，1,5-二氯蒽醌与1,8-二氯蒽醌在两张色谱图中互为镜像，此外区别还在与图2A与图2B中的两个色谱峰的峰面积的绝对值的差异。上述现象，亦可说明反相液相色谱系统峰的形成与流动相的组成以及样品溶剂组成之间具有密不可分的关联。
又如下图3所示，流动相为乙腈-水体系，流动相中还添加有另外两种添加剂，浓度分别为0.001 M，采用等度洗脱模式。该图可以更加直观地呈现多种添加剂存在的反相液相色谱中系统峰变化的概况。
一般地，当我们对样品进行分析的时候，优先使用流动相溶解或者稀释样品，尽可能地减少由溶剂引起的一些不良的色谱现象(如溶剂效应等)，此外也能够减小进样操作对于色谱平衡状态的干扰程度。但在医药工艺以及药物分析过程中，医药中间体以及终产品多含有酸/碱官能团，为了获得优异的色谱峰峰形，流动相中往往会添加有机酸碱添加剂甚至需要使用不同种类、不同pH的缓冲盐作为添加剂。由于各种添加剂的使用，导致流动相的组成比较复杂，且各组成成分在色谱柱固定相以及流动相之间分配并达到平衡。
为了充分减少溶剂组成与流动相的组成不同引起的诸如溶剂效应等一系列问题，我们会尽可能的使用流动相作为溶剂，但有的时候，待分析化合物对于酸或者碱性环境不稳定，这时为了保证样品分析时效内的稳定性，不可避免地要使用与流动相不同的溶剂来溶解样品。除此之外，一些难溶性的样品，有时候会使用到DMSO或者DMF作为助溶剂，而与此同时，我们不可能在流动相中添加这些助溶剂，这也导致溶解样品的溶剂与流动相的组成不同的情形。
以上，我们也只是针对等度洗脱模式进行的讨论，而对于梯度洗脱模式，流动相中的各种组成成分的分配平衡过程就要复杂的多。因此系统峰的出现，基本不可避免，特别是使用酸碱等具有强紫外吸收的添加剂，缓冲盐以及离子对试剂的时候。
3反相液相色谱系统峰的个数
一般地来说，按照反相液相色谱系统峰理论，反相液相色谱流动相的组成为N的话，如果检测器允许，将可检测到N-1个系统峰，而系统峰的正负，与检测手段有关。
如下图所示，流动相组成为乙腈：水=4：96，其中添加TFA，浓度为0.1%；样品为空白，其组成为乙腈：水=4.4：95.6，其中添加TFA，浓度为0.1%。从下图中，我们看到有四个色谱峰，依次为死体积处色谱峰，溶解氧色谱峰，TFA与乙腈的叠加色谱峰以及添加剂TFA引起的空穴效应倒色谱峰。
此外，从图中也可以看出，TFA与乙腈的叠加色谱峰面积的绝对值要大于添加剂TFA引起的空穴效应倒色谱峰面积的绝对值，其原因也显而易见，在扣除乙腈所引起的色谱峰面积之后，二者面积的绝对值，在理论上讲，应该是一致的。
如上图实例，流动相中有水，乙腈，TFA以及溶解氧，共四种组分，而在色谱图上却只看到2个色谱峰（最后一个为空穴效应倒色谱峰）。这是由于TFA在普通的C18色谱柱上容量因子较小，基本不能做到较有效的保留，引起与乙腈色谱峰的重叠，导致实际观察到的系统色谱峰个数减少的现象。
4反相液相色谱系统峰的形成的理论解释
按照色谱塔板理论，将色谱柱等效为有限元个塔板，溶质在各塔板内均要达到分配平衡，经过适当演化，可得到下述两个数学模型，如下图5。
其中，mm为平衡时流动相中的溶质质量，k’为溶质的容量因子，ms为平衡时固定相中的溶质质量，mtotal为总质量；上角标t为任一时刻，下角标i为任一塔板。
假设流动相的组成为乙腈与水，其中添加0.1%的TFA，使用前经超声处理，将上述模型做以改变，如下图6所示
在这里，首先假定乙腈在很小的变化范围内的时候，其分配系数维持常数，而TFA的分配系数则与乙腈的浓度呈现线性相关的关系。按照上述模型进行计算机模拟，流动相组成为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA。
如上图7A所示，红色为进样乙腈：水=4.4：95.6，含有0.1%TFA的空白溶液，蓝色为进样乙腈：水=4.4：95.6，绿色为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA；上图7B则为，红色为进样乙腈：水=3.6：96.4，含有0.1%TFA的空白溶液，蓝色为进样乙腈：水=3.6：96.4，绿色为乙腈：水=4：96，添加剂为0.1%的TFA。
上图7A与7B的区别在于乙腈引起的色谱峰的正负性以及TFA的色谱峰及其引起的空穴效应色谱峰的先后关系。其中图7A与图4的实际色谱状况完全一致。
此外也可直观地对上述模拟结果进行解释，如对于图7A，进样溶液的乙腈的组成比流动相的组成要高0.4%，由于一定的小范围内乙腈的分配系数近似于常数，高浓度的乙腈色谱带经色谱柱后形成正色谱峰。对于TFA，虽然进样溶液与流动相中的浓度均为0.1%，但是TFA的分配系数随乙腈浓度的变化而线性改变，当高浓度的乙腈溶液被注入色谱柱之后，由于该色谱带的乙腈浓度高，TFA在固定相内的分配相应减少而导致检测器处检测到正峰，在该进样色谱带之后，乙腈的浓度得到重新恢复，固定相中的TFA的分配势必得到增加，在检测器处形成空穴效应倒峰，如果仔细比较可以发现二者的紫外吸收光谱互为镜像。
如前所述，TFA基本不被C18色谱柱保留的特性，导致出峰位置与乙腈重合，可以使用PFBA作为相应的添加剂，其他条件不变，对系统峰进行指认(PFBA能够被有效保留)，如下图8所示。
P1色谱峰为乙腈色谱峰，P2色谱峰为PFBA色谱峰，P3为溶氧色谱峰，P4为PFBA引起的空穴效应的倒峰，且其面积的绝对值与PFBA色谱峰面积的绝对值相等。
以上为等度模式下，系统峰所具有的特点及其形成原因。在梯度模式下就相对比较复杂了。与等度模式下一样，同样与色谱柱的类型以及流动相的组成以及配样溶液的组成有很大的关系。一般地，对于强紫外吸收的添加剂，随着梯度的运行，早期色谱图上多会形成一个比较突出的色谱平台或鼓包。
5结论
反相液相色谱中的系统峰，一般是独立于样品而存在的，其形状及形成的原因与流动相的组成，色谱柱的类型以及配制样品所用的溶剂有关。系统峰的形成，可按照经典色谱塔板理论辅助计算机模拟进行解释，也可以根据分配-平衡进行简单描述。然而，在梯度洗脱模式下，系统峰的形状以及形成原因还与梯度的斜率以及方法前平衡时间的长短有关。
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Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
作者公众号：Pharma_Analytical
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