Carfilzomib的研发历程
天然活性产物具有结构新颖，药理活性多样的特点，是新药创制的重要来源，临床上有约50%的药物直接或间接来源于天然产物，但大多数天然产物存在活性弱、特异性低、类药性差等缺点，因此需要根据其不足，有针对性的进行结构优化。
Carfilzomib(商品名Kyprolis)是美国Onys制药公司开发的新一代蛋白酶体抑制剂，于2012年7月20日获得FDA批准上市，主要用于曾接受过两种或以上过往治疗方案(包括Bortezomib和免疫调节剂治疗)的多发性骨髓瘤患者。多发性骨髓瘤是恶性浆细胞在骨髓中克隆增生性疾病，也是一种较为罕见的致命疾病。作为一种罕见病用药，Carfilzomib是在美国FDA加速审批程序下获得批准的。
蛋白酶体是真核生物细胞内降解蛋白质的核心部分，是一类桶装复合物，由1个20S核心颗粒和2个19S调节颗粒和许多多肽亚基组成。真核生物体中β1、β2、β5亚基具有水解蛋白的活性特点，其中β5亚基(糜蛋白酶样活性)负责大部分蛋白质的水解。蛋白酶体水解蛋白质时，首先产生具有活性的苏氨酸，在水传递电子的作用下，Thr1Oγ亲核进攻肽键的羰基，发生水解反应。
抑制蛋白酶体的水解活性会增加毒性蛋白、激活凋亡通路、导致细胞凋亡；在增殖活跃的肿瘤细胞中，由于异常蛋白的迅速积累致使蛋白酶体高表达，蛋白酶体的活性比正常细胞中更强。因而肿瘤细胞对抑制蛋白酶体活性导致的凋亡作用更敏感，因此，蛋白酶体被认为是治疗肿瘤的靶标。
来源于微生物的天然产物Epoxomicin是一个具有环氧酮结构的天然线性多肽，于20世纪90年代，由百时美施贵宝(BMS)的东京研发部从编号Q996 -17的放线菌菌株中首次分离得到。尽管它在体内、体外均表现出很强的抗肿瘤活性(对鼠源黑色素瘤B16 - F10和白血病P388细胞株增殖抑制的IC50均为2 ng·mL-1；对BDF1小鼠B16黑色素瘤静脉给药的有效剂量为每天0. 13mg·kg-1)，但BMS认为其有不稳定的环氧酮结构和较差的类药性质，加之抗肿瘤机制不明确，因此放弃了进一步的研究。与此同时，耶鲁大学的Crews小组对Epoxomicin很感兴趣：一方面其体外体内抗癌活性很强；另一方面其环氧结构可能与蛋白通过共价键结合，易于获得靶蛋白，从而解释其抗癌的作用机制。Crews小组通过全合成得到了Epoxomicin，并利用生物素标记原理合成了分子探针，通过探针确立靶蛋白为蛋白酶体β1、β2i 和β5i 亚基。合成的Epoxomicin能选择性地抑制蛋白酶体活性，不抑制其他蛋白酶如木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等。
为了解释Epoxomicin高度选择性的原因，确定其与蛋白酶体结合的机理，Crews与慕尼黑理工大学的Groll合作得到了Epoxomicin和酵母菌蛋白酶体的晶体复合物。通过晶体复合物发现Epoxomicin的羰基部分被蛋白酶体的Thr1Oγ进攻后形成半缩醛结构复合物，这个复合物分子中亲核性的Thr1N继而亲核进攻环氧，生成了6-exo-tet的吗啉环。这样的两步反应使Epoxomicin和蛋白酶体通过共价键不可逆地紧密结合在一起。当时在研的蛋白酶体抑制剂如醛肽类、烯砜肽类、硼酸肽类等，除了和蛋白酶体以共价键结合外，还与其他具有亲核性基团的蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶结合，有不同程度的脱靶作用，使得疗效较差，毒副作用较大。而Epoxomicin这种通过两步反应形成共价键的机制，决定了它对具有独特Thr1结构的蛋白酶体有特异选择性，优于以往的蛋白酶体抑制剂，具有潜在成药性。
Epoxomicin和蛋白酶体的结合机制
因为Epoxomicin 表现出了很强的蛋白酶体β5亚基的选择性抑制活性，所以Crews小组期望通过结构优化，得到蛋白酶体抑制活性和抗癌活性更强、成药性更好的候选药物。Epoxomicin的结构可分为两个部分：环氧酮部分和四肽部分(四肽部分根据与蛋白酶体水解位点的距离分别为P1 ~P4)，下面分别对它们进行结构优化。
Epoxomicin多肽结构示意图
2.1环氧酮部分的改造
由上文的作用机制可以看出，Epoxomicin的环氧结构是进行共价结合的活性必须基团。同时早期研究也表明，环氧结构为2R构型时有活性，而为2S构型时则活性降低或消失，说明具有一定立体构型的环氧片段是保持活性所必需的，因而不对该部分进行改造。
2.2肽链的长度与活性的关系
相关研究表明：蛋白酶体的20S催化亚基中的多个口袋，可以与多肽的侧链发生相互作用，而P1片段是该类4肽衍生物与蛋白酶体结合的关键位置。当P1区域为亮氨酸或苯丙氨酸时，可以有效提高对β5亚基的选择性；而为碱性片段如赖氨酸和精氨酸时，β5亚基的选择性降低。因此，研发人员首先将R1 ~ R4的取代基都改为异丁基，设计并合成化合物1 ~ 4，考察活性与链长的关系(见表1)。
表1 肽链长度与蛋白酶体不同亚基抑制活性关系
注：*使用牛红细胞20S蛋白酶体，室温测定，取9次试验平均值；- 表示150μmol·L -1 条件下未见阳性结果或结果无统计学意义.
结果表明，肽链为四肽长度时，选择性和活性都最佳，肽链长度的缩短将导致活性和选择性的下降，推测可能与蛋白酶体催化位点口袋尺寸有关。
2.3 R2 ~ R4取代基的优化
在确定了四肽环氧酮为基本骨架后，研究人员以化合物1为基础，通过改变R2 ~ R4片段的氨基酸种类来探究其对活性的影响(见表2)。
表2化合物5 ~15对蛋白酶体不同亚基抑制活性
注：*使用牛红细胞20S蛋白酶体，室温测定，取9次试验平均值；- 表示150μmol·L -1 条件下未见阳性结果或结果无统计学意义.
首先保持R3、R4都为异丁基，改变R2的取代基，得到化合物5 ~ 7。体外活性测试表明，R2基团为脂肪族取代基，活性较差；为芳香性取代基时，对酶的抑制效果以及选择性都有显著提高，尤其以苯乙基取代时，结果最优。
其次保持R2、R4取代基为异丁基不变，改变R3取代基，获得化合物8 ~ 10，发现将化合物1的R3取代基改为其他疏水性片段后，对酶抑制效果与选择性都降低了，所以R3取代基仍旧保持为异丁基。
随后再保持R2、R3取代基不变时，改变R4取代基的结构，获得化合物12 ~ 15，发现为芳香取代时，活性普遍较好，且以苯乙基取代时，选择性与活性最优。
基于以上结果，科研人员将R2、R3、R4 的最优基团结合在一起，得到了化合物16 (YU - 101)，以及其N -去乙酰基衍生物17。活性测试显示，化合物17的活性、选择性均较弱；16的活性、选择性更佳，其抑制蛋白酶体β5亚基的活性明显强于Epoxomicin 和Bortezomib 等蛋白酶体抑制剂，并且在体内具有强抗炎活性。
表3 化合物16、17 对蛋白酶体不同亚基抑制活性
注：*使用牛红细胞20S蛋白酶体，室温测定，取9次试验平均值
2.4 候选化合物
PR171的确定 Crews将YU-101转让给了Proteolix制药公司(后被Onyx收购)，Proteolix继续进行改造得到了上百个化合物，但活性都不如YU - 101。尽管YU -101抗肿瘤效果显著，但Proteolix公司很快发现YU - 101的水溶性差，难以成药，因此引入吗啉环，合成了活性保持而水溶性增加几个数量级的化合物PR - 171，并以此作为候选化合物进入临床研究。
Carfizomib 的优化过程
Carfilzomib从具有抗癌活性的天然产物Epoxomicin的发现，到其抑制蛋白酶体活性作用机制的阐明，再到通过结构改造发现活性更强化合物YU -101，最终到水溶性更好的Carfilzomib上市。
3.1生物界的次生代谢产物是为了自身的生长和种群的繁衍而产生的，生来不是为了给人类治病，毒性、成药性等方面的缺陷决定了需要对它们进行结构改造。面对作用机制不明，类药性差等问题，应根据所研究的天然产物的性质，进行个性化、量体裁衣式地改造，有针对性地优化药效、药代、安全性等性质。
3.2明确作用机制有利于进一步的修饰改造。Epoxomicin独特的两步形成共价结合的机制的阐明，不仅明确了作用靶标为蛋白酶体，同时提示了环氧酮基团的必要性，为接下来的改造工作提供了便利。
3.3研发的新药必须要比上市或准上市药物更具有优势。在Epoxomicin 的改造过程中，首个蛋白酶体抑制剂Bortezomib 进入临床并批准上市，这对其他蛋白酶体抑制剂的开发也带来了更大的挑战和压力。但Bortezomib 由于其可逆结合的机制，毒副作用较大且易耐药；而Epoxomicin作用机制独特：它选择性不可逆抑制蛋白酶体，以其为基础研发的第二代蛋白酶体抑制剂Carfilzomib 克服了Bortezomib毒副作用大的缺点，同时对Bortezomib 耐药的病人也有效果，故而得以在Bortezomib 之后上市。
参考资料
1.Epoxomicin，a new antitumor agent of microbial origin.
2.Epoxomicin，a potent andselective proteasome inhibitor，exhibits in vivoantiinflammatory activity.
3.Antitumor activity of PR -171，a novel irreversible inhibitor of theproteasome.
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