毒药新用——甲之砒霜，乙之蜜糖

三氧化二砷(As₂O₃)注射液(Trisenox^®)，在2000年9月25日获FDA批准用于治疗难治性复发性急性早幼粒性白血病(APL)，由Cephalon的(Teva子公司)上市销售，后于2016年11月经EMA批准联合维甲酸一线治疗新确诊中低危急性早幼粒细胞白血病。砒霜，历史上赫赫有名的毒药，自此开始作为治疗药物进入人们的视野。那As₂O₃是如何改善人类的健康的，国内的研究者对此也做出了巨大贡献，本文对As₂O₃的发现、药用机理、临床疗效、安全性及国内研发情况简单介绍，揭开“砒霜蜜糖”之谜。

砒霜与As₂O₃

砒霜又叫信石或鹤顶红，作为历史八大名毒药之一，汉质帝刘缵和武大郎均死于此毒药。砒霜的主要成分是三氧化二砷。自然界的砷主要以雄黄(As₄S₄)和雌黄(As₂S₃)两种形式存在，雄黄和雌黄加热到一定温度后砷在空气中被氧化As₂O₃。古代的银针试毒测试的就是不纯砒霜里的硫化物。As₂O₃外观为白色霜状粉末，故称砒霜。As₂O₃为无机剧毒品，致死量为0.1-0.2g。

国内As₂O₃的发现过程：从毒药到治疗白血病药物

古人云“以毒攻毒”、“一物降一物”，药力太过就变成了毒药，反之控制毒力又可成药，千百年来莫不如此。作为以毒攻毒的典范，砒霜也有作为入药的记载，孙思邈在《备急千金要方》中首创利用砒霜治疗疟疾，北宋的《开宝本草》、明朝李时珍的《本草纲目》都记载了砒霜的药性，明末清初陈司成用锻炼后的砒霜治疗梅毒。西方在20世纪也有用亚砷酸钾治疗白血病的记载，但未获普遍接受^[1]。

20世纪70年代，国家要求城市医生到乡下为农民看病，因此组成了“城市流动医疗队”服务乡村，并强调“中国医药学是一个伟大的宝库，应当努力发掘，加以提高”。在巡回过程中哈医大一院的韩太云等发现由砒霜、轻粉(氯化亚汞)和蟾酥构成的“713”注射液对某些肿瘤有效，但是毒性较大。1973年，张亭栋等人明确了以砒霜和微量轻粉构成的“癌灵1号”注射液对白血病的治疗作用。1974年，他们以哈医大一院中医科和检验科的署名，发表论文明确提出“癌灵1号”可以治疗多种白血病，有些急性白血病可以达到完全缓解(CR)。1979年，张亭栋等人在《黑龙江医药》发表论文，明确了“癌灵1号”的有效成分为As₂O₃，并且指出对急性早幼粒白血病(APL)效果最好，也就是现在的M3型白血病^[1]。

至此，国内研究者最早提出As2O3治疗M3型白血病(APL)的概念。但是，由于国内的杂志多为中文，国内的研究结果并未被国际医学界知晓和接受。直到1998年，《新英格兰医学杂志》报道了纪念斯隆-凯特琳癌症中心和康奈尔医学院的研究，以As₂O₃治疗APL病人，并且几乎达到完全缓解，国际医学界才广泛接受As₂O₃对APL的治疗作用^[2]。

As₂O₃治疗APL的机制

(1)As₂O₃诱导APL细胞分化和凋亡

研究表明，As₂O₃能够通过诱导细胞分化和凋亡两个不同途径促进APL患者缓解^[3](图1)。大剂量的As₂O₃(0.5-2.0 μM)能够诱导白血病的细胞凋亡：As₂O₃与巯基等相关基团发生共价反应，如在线粒体中通过Bcl-2和PTPC等特异性蛋白降低线粒体膜电位(ΔΨm)，电位变化导致细胞色素C释放，从而激活半胱天冬酶级联反应，诱导细胞凋亡。膜电位的变化还能够增加线粒体ROS的释放。另外，As₂O₃也可以通过其他途径诱导细胞凋亡，如抑制抗氧化酶GPx进一步提高ROS水平；还能通过抑制IKK进一步限制细胞存活因子NFκB的活化，促进细胞凋亡^[4]。低剂量As₂O₃(0.1-0.5μM)能够诱导的分化，可能与cAMP途径、核受体活性或组蛋白乙酰化的调节有关。

图1：As₂O₃促进APL细胞的分化和凋亡诱导作用机制(来源于参考文献3)

(2)As₂O₃诱导致癌蛋白PML及PML-RARα降解

无论是低浓度诱导分化还是高浓度的诱导凋亡，As₂O₃都是通过与致癌蛋白PML-RARα/PML巯基间的共价结合降解PML-RARα而发挥作用。研究表明，PML-RARα融合蛋白在超过98%的APL中表达。

以陈竺、陈赛娟和王振义为代表的国内科研工作者开展了As₂O₃治疗APL的分子机制学研究。APL是AML的一种亚型(M3)，由于t(15；17)染色体易位，即15号染色体上早幼粒细胞性白血病基因(PML)和17号染色体上的维甲酸受体基因(RARα)，产生异常的PML-RARα融合基因，表达癌蛋白PML-RARα(图2)，PML-RARα既能阻断细胞分化，又能抑制凋亡。因此，t(15；17)染色体易位产生异常的PML-RARα融合基因可能是APL发病的主要机制之一。

图2：A. PML-RARα结构：由PML蛋白N端的R域、B1/B2域、CC域及RARα构成，PML-R和PML-B是锌指区(ZF)，富含半胱氨酸，参与砷的结合

陈赛娟和陈竺等人在Science发文提出As₂O₃诱导PML和PML-RARα降解的机制^[5]：砷剂通过结合PML-RBCC蛋白或PML-RARα蛋白锌指区的半胱氨酸残基上，或者结合在两个同二聚体之间交联形成的锌指区中半胱氨酸，如ZF1中Cys60、Cys77、Cys80和ZF2的Cys72、Cys88、Cys91(图3)，诱导PML蛋白或者PML-RARα融合蛋白的构象发生变化(图4)，促进PML-RARα或PML蛋白的进一步寡聚化，增强与泛素化酶UBC9的相互作用或增加修饰位点的暴露促进这些蛋白质的SUMO化。最终导致PML和PML-RARα致癌蛋白的泛素化和降解增强，诱导APL白血病细胞分化和凋亡。文章提出将PML和PML-RARα致癌蛋白作为As₂O₃的直接靶标，这一作用机理为As₂O₃在未来白血病治疗中的应用开辟了新的前景。

图3：砷(蓝色小球)与PML-R-ZF1的Cys60、Cys77、Cys80及与ZF2的Cys72、Cys88、Cys91形成配位，而锌(黄色小球)与保守的半胱氨酸和组氨酸残基表现出典型的四面体配位

图4：As₂O₃控制PML和PML-RARα命运的机制模型图

As₂O₃治疗APL的临床研究

(1)As₂O₃治疗复发性APL的试点临床研究

国内的研究者使用As₂O₃治疗APL病人获得CR的结果引起了纪念斯隆-凯特琳癌症中心研究者的兴趣。他们启动了一项As₂O₃治疗全反式维甲酸(ATRA)和蒽环类药物化疗后复发的APL患者的试点研究[2]。结果表明，单独使用As₂O₃治疗后，12名患者中11名达到CR。其中11个应答者中的8人实现了分子水平的缓解，患者体内已经检测不到APL致癌基因——PML-RARα融合基因的表达。

(2)As₂O₃治疗复发性APL的有效性

在试点研究取得成功之后，研究者开启了一项更大规模的开放标签、多中心单臂试验(PLRXAS01)^[6]，用As₂O₃对40名复发或难治性APL患者进行治疗(患者接受过蒽环类和TARA治疗后复发)。与预期结果一致，40名患者中有34名(85%)达到CR，并且所有达到CR的患者PML-RARα融合基因不表达。在后期随访中，仍有27例患者存活，中位随访时间为484天。这项关键性试验为As₂O₃获批治疗ATRA/蒽环类药物治疗无应答或复发的APL患者提供有力的数据支持。

(3)As₂O₃的安全性

自古以来砒霜就作为毒药被广泛应用。无机砷也被国际癌症研究机构和美国环境保护局列为致癌物质。长期暴露于低浓度砷环境会增加皮肤瘤、肝癌、膀胱癌和肺癌的发病率。砷中毒会引起周围神经病变、心肌病和肾功能衰竭等症状。

但是抛开剂量谈毒性都是不合适的。作为治疗药物，病人以0.15mg/kg/天的剂量静脉注射As₂O₃时具有良好的耐受性。能够观察到轻微反应是白细胞增多、胃肠病症(例如恶心、呕吐、腹泻)、疲劳、发烧、头痛、咳嗽和呼吸困难等不良反应，并无3级以上严重的肝肾损伤。长期使用As₂O₃联合ATRA治疗APL也并不会发生继发性肿瘤。

但As₂O₃治疗APL会出现APL分化综合征(APLDS)和心电图(ECG)异常等严重不良反应^[6]。APLDS又被称为“维甲酸综合征”，可在ATRA或As₂O₃缓解诱导治疗期间出现，症状包括发烧、呼吸困难、低血压、体重增加、急性肾功能衰竭和肺部浸润等。在As₂O₃治疗APL的关键临床试验中(PLRXAS01)，APLDS的发生率为25%(10例)，其中三名患者的APLDS较严重。但是，发生APLDS患者都达到了CR。同样，As₂O₃联用ATRA治疗APL的临床试验中，APLDS的发生率和严重程度与单用As₂O₃相似。另外，As₂O₃治疗APL可导致患者心电图异常，包括QT间期延长和完全房室传导阻滞。在PLRXAS01试验中，63%的患者观察到QT间期延长。在其他研究中As₂O₃也会导致其他心脏不良事件包括房性心律失常和心肌梗死。因此，在砷剂治疗前和治疗期间，应及时进行心电图和电解质监测。

As₂O_{3在其他疾病的应用}

As₂O₃除了被批准应用于治疗APL外，还有多项针对其他实体瘤和血液瘤的临床研究正在进行之中。

单用或联用其他药物如抗坏血酸、美法仑、地塞米松和硼替佐米治疗复发性难治性多发性骨髓瘤(MM)，临床研究已初步证明联用的有效性。As₂O₃联合沙利度胺和维甲酸治疗骨髓增生异常综合征(MDS)也显示出临床疗效。另外，As₂O₃联用低剂量阿糖胞苷治疗AML、联用干扰素α(IFNα)应用于人T细胞嗜淋巴细胞病毒I型(HTLV-I)相关的成体T细胞白血病淋巴瘤(ATL)的临床试验也在进行中。

As₂O₃治疗各种实体肿瘤，包括膀胱癌、胶质瘤、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、生殖细胞肿瘤、肺癌和黑色素瘤也在研究之中。据报道，单用As₂O₃在肝细胞癌(HCC)、黑色素瘤和肾细胞癌的临床效果有限，但是As₂O₃联用化疗药在骨肉瘤和尤文肉瘤中显示一定的治疗作用。

As₂O_{3国内研发情况}

到目前为止，用于治疗APL的三氧化二砷仅有注射液及冻干粉针剂等注射型被批准应用于临床，针对其他剂型如口服溶液和胶囊剂型的研究也在进行之中。另有复方三氧化二砷糊剂用于治疗牙髓失活。

直到2008年，国内才有国产化的As₂O₃注射液上市，给国内APL患者带来治疗的希望。国内注册的企业主要有北京双鹭和海南中化。另外有上海遥健医疗和济南川成医药以2.2类新药申请的口服液正在审评审批中。

图5：As₂O₃的国内注册企业(来源于药渡数据)

总结

As₂O₃用于治疗APL虽为我国医药工作者首先发现，但由于历史原因，未及时申请专利申请，也未能早于国外企业将As₂O₃推向市场。不过，从此例中我们意识到，中国宝贵的中药资源中可能进一步改善人类健康的有效成分，或许还沉睡着、尚未开发。从传统药物中寻找全新化学结构的药物、发现已有天然产物的新用途值，这得我们后辈继续探索。

参考文献

[1]饶毅, 黎润红, 张大庆. 中药的科学研究丰碑[J]. 科技导报, 2015, 33(20):132-136.

[2] N Engl J Med. 1998 Nov 5;339(19):1341-8.

[3]Zhang T D , Chen G Q , Wang Z G , et al. Arsenic trioxide, a therapeutic agent for APL.[J]. Oncogene, 2001, 20(49):7146-7153.

[4]Emadi A , Gore S D . Arsenic Trioxide – An Old Drug Rediscovered[J]. Blood reviews, 2010, 24(4-5):191-199.

[5] Zhang X , Yan X , Zhou Z , et al. Arsenic Trioxide Controls the Fate of the PML-RAR alpha Oncoprotein by Directly Binding PML[J]. Science, 2010.

[6] Soignet SL, Frankel SR, Douer D, et al. United States multicenter study of arsenic trioxide in relapsed acute promyelocytic leukemia. J Clin Oncol2001; 19:3852–60.

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