推动PROTAC药物开发新纪元：扩展PROTAC的E3连接酶
靶向蛋白降解(Targeted protein degradation, TPD)作为一种新兴的治疗策略被广泛关注，它可以靶向以前被认为“不可成药”的蛋白质。PROTAC是TPD的主要焦点，它同时招募并结合E3连接酶和靶蛋白(POI)，从而形成E3-降解蛋白POI三元复合物，诱导POI泛素化和随后的蛋白体降解。
鉴于PROTAC巨大的治疗潜力和独特的机制，该领域引起了学术界和制药行业的极大兴趣，目前已有250种药物被PROTACs进行降解测试。尽管PROTAC具有广泛的治疗潜力，但在人类基因组的数百种E3连接酶中，目前只有不到2%的E3连接酶参与了TPD领域的研究，因此，需要招募更多的E3连接酶来进一步增强TPD的治疗潜力。
近日，美国国家癌症中心的Eytan Ruppin教授和印第安纳大学医学院生物统计与健康数据科学系Leng Han教授团队研究人员对1075个E3连接酶进行了表征，最终确定了76种有潜力的E3连接酶，扩展了PROTAC的E3连接酶版图，推动了PROTACs药物的开发进展。
研究人员收集了E3连接酶的综合列表(图1a)，并利用大规模数据资源、实验证据和人工智能(AI)工具来描绘E3连接酶的七个不同的关键维度：
化学配位性，表征E3连接酶的粘合剂可用性;
E3连接酶在肿瘤和正常样本中单细胞水平和整体水平的表达模式;
进一步表征其潜在蛋白靶点的E3连接酶的PPI;
在PROTAC设计中应优先考虑的其他重要因素，包括结构可用性、功能必要性、细胞定位和E3连接酶的PPI接口(图1b)。
之后，他们基于三十个大规模数据集分析，包括3个E3连接酶列表、5个配体库、5个表达图谱、7个互作数据库、2个结构数据库、2个重要性筛选、3个细胞定位数据库和3种互作界面数据库，研究人员揭示了几种有前途的现存的E3连接酶。
PART.
01
化学配位性
表征E3连接酶的粘合剂可用性
为了寻找可能促进E3连接酶募集的新的药物，研究人员采用基于深度学习的虚拟筛选配体模型HyperAttentionDTI31，在DrugBank25中搜索E3连接酶与药物之间潜在的相互作用。
在评估和应用该模型后，研究人员获得了预测的药物-靶标相互作用，包括潜在的新型E3连接酶，如Makorin Ring Finger Protein 1 (MKRN1)，与关键肿瘤驱动因子TP53和APC32具有ppi，并预测与DB13955(雌二醇二酸酯)和DB03017(月桂酸)相互作用。利用这些药物可能会增加潜在的新型E3连接酶的配体性，从而靶向其他肿瘤靶点。他们系统分析利用了五个大规模的数据源，并揭示了许多新的E3连接酶和数十种可用的配体，这些配体可能用于PROTAC的开发。
PART.
02
E3连接酶在肿瘤和正常样本中
单细胞及整体水平的表达模式
通过对肿瘤和正常组织的整合分析，研究人员确定了206个E3连接酶，包括3个增选的和203个新的E3连接酶，它们在TCGA和HPA病理中至少一种肿瘤类型中高表达，而在GTEx和Tabula及大多数正常组织中低表达。除了这3种被采用的E3连接酶，这203种潜在的新型E3连接酶揭示了一个大型的E3连接酶库，可用于抗癌PROTAC的开发。
研究人员全面描绘了大细胞水平和单细胞水平的转录组表达，以及E3连接酶的蛋白质组表达，证明了利用大规模表达数据进一步推进PROTAC提高疗效和规避副作用的必要性。
PART.
03
E3连接酶与POI蛋白
相互作用(PPI)的综合图谱
蛋白质被PROTAC降解的可能性因靶蛋白而异，总结E3连接酶相关的ppi应优先考虑能被PROTAC高降解的靶蛋白。为了确定这些PROTAC靶点，研究人员将PROTACtable基因组和基于模型的蛋白质降解性分析(MAPD)两项研究的结果结合起来，对靶点的PROTACtable可降解性进行了评估。这两项研究突出了3280个PROTAC可处理靶点，其中1025个靶点重叠。
研究人员还发现了一些PPIs涉及PROTAC可治疗的癌症靶点，这些靶点尚未在PROTAC中被探索。例如，神经母细胞瘤RAS(NRAS)与转移性结直肠癌的不良预后相关，有证据表明PPIs具有增选的E3连接酶BIRC2和XIAP，以及潜在的新型E3连接酶CDC20和SKP2。另一个PROTAC可处理的靶点是Rac Family Small GTPase 1 (RAC1)，它诱导乳腺癌的化疗耐药，与增选的E3连接酶MDM2和XIAP以及潜在的新型E3连接酶ITCH和SMURF2相互作用。在开发针对这些癌症靶点的PROTACs时，可以考虑相应的E3连接酶。
PART.
04
E3连接酶的结构可用性、
功能必要性、细胞位置和PPI接口
首先，为了获得E3连接酶的可用蛋白质结构，研究人员查询了世界范围内的结构数据库protein Data Bank (PDB)，鉴定出414个具有实验确定结构的E3连接酶。这些可用的蛋白质结构，为招募潜在的新E3连接酶提供了很好的机会。
图2. E3连接信息汇总
然后，研究人员利用依赖图谱(DepMap)61中的CRISPR和RNAi技术，研究了E3连接酶的遗传扰动，评估了癌细胞系中基因的必要性。他们在CRISPR筛选中鉴定出146个肿瘤必需的E3连接酶，包括两个增选的E3连接酶——VHL和RNF4。
紧接着，为了确定E3连接酶的细胞位置，研究人员整合了来自COMPARTMENTS、Gene Ontology (GO)和UniProt的高质量数据。发现983个E3连接酶被细胞质和/或细胞核注释，这被认为是PROTAC的首选位置。这些潜在的新型E3连接酶，为实现受限或需要降解的亚细胞定位提供了一种通用的选择。
最后，研究人员从多种来源收集到跨越928个E3连接酶，包括11个增选的E3连接酶的PPI界面。基于此可以指导人们确定E3连接酶或靶标中观察到的突变是否位于界面区域，从而可能进一步破坏E3连接酶与靶标的相互作用。
PART.
05
局限与展望
然而，此研究目前也有一定的局限性，首先针对E3连接酶的研究主要集中在有限数量的E3连接酶上，如VHL/CRBN，缺少其他蛋白经验；其次由于目前缺乏大规模的单细胞蛋白质组学数据，无法更高分辨分析E3连接酶的活性，最后翻译后修饰(PTM)在调节E3连接酶的活性和丰度（丰度指的是E3连接酶的相对含量）方面也起着关键作用。
PTM对PROTAC中E3的调控作用在很大程度上是未知的，大规模的高分辨率PTM数据还无法实现。因此，该网站为用户提供了根据他们的偏好选择数据源的选项。除了为PROTAC寻找新的E3连接酶外，E3连接酶的信息也可以被其他TPD领域所利用，如蛋白水解靶向抗体(PROTAB)和分子胶。
总之，该研究通过分析30个大规模数据集，从7个不同的方面系统地表征了E3连接酶，包括化学配体性、表达模式、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)、结构可用性、功能必要性、细胞位置和PPI接口。揭示了几种有前途的现存的E3连接酶。综合置信度评分、配位性、表达模式和PPI，确定了76个E3连接酶作为PROTAC相互作用的候选酶。
此外，尽管新开发的PROTAC大部分用于癌症治疗，但研究人员对E3连接酶的综合分析也可以从癌症转移到其他领域的治疗开发，例如：治疗神经和/或免疫疾病。期待E3连接酶能够持续助力PROTAC药物的开发，造福更多患者！
参考文献：
1.Liu Y, Yang J, Wang T, Luo M, Chen Y, Chen C, Ronai Z, Zhou Y, Ruppin E, Han L. Expanding PROTACtable genome universe of E3 ligases. Nat Commun. 2023 Oct 16;14(1):6509. doi: 10.1038/s41467-023-42233-2.
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