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肝癌检测的5大类肿瘤标志物，你都了解吗？
5大类肿瘤标志物整理，来，吃下这波干货！
肝细胞癌(HCC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内占所有癌症发病率的第5位，且发病率仍在逐年上升，死亡率居第3位。
图注：Li B. Global cancer statistics, 2012[J]. Ca A Cancer Journal for Clinicians, 2011, 61(2):69.
蛋白类肿瘤标志物
AFP是目前全世界应用最广泛的HCC肿瘤标志物，诊断HCC的敏感度为39%～65%，特异度为76%～94%。其敏感度和特异度均不令人十分满意，尤其在具有小肿块的HCC早期阶段，80%的患者血清AFP并未见明显升高，在肿块直径＜3 cm和＞3 cm的HCC患者中，AFP的检测敏感度分别为25%和52%。
GP73在正常人的肝细胞中表达量极低或者不表达，而在HCC患者血清中明显升高，尽管肝炎和脂肪肝也可导致GP73水平升高，但其升高程度远远低于HCC患者。研究显示在低水平AFP小肝癌患者中，GP73检测敏感度和特异度分别为72.0%和94.0%。故GP73是一个较好的小肝癌的辅助诊断标志物。
AFP-L3是AFP异质体的一种，常用AFP-L3与AFP的百分比作为HCC早期诊断的标志物。AFP-L3为肝癌细胞特有，AFP-L3在肝癌恶性程度评估、治疗效果和预后判定方面有着重要的意义，尤其对低水平AFP肝癌或小肝癌的早期诊断意义较大。
GPC-3是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白，在正常人肝脏中并不表达，在HCC患者中明显高于良性肝脏疾病患者，因此其有助于HCC的早期诊断和良恶性肝肿瘤的鉴别诊断。目前，GPC-3的敏感度和特异度分别为36%～65%、65%～100%，且在小肝癌的检测方面敏感度优于AFP。
研究表明HSP27的表达可通过线粒体死亡胱天蛋白酶依赖的途径从而诱导肿瘤细胞凋亡作用，特别是在HCC细胞中。因而HSP27对诊断HCC具有潜在价值。
OPN是一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白，存在于人体多种组织细胞中，尤其是恶性转化的上皮细胞，HCC患者血清OPN水平明显高于良性慢性肝病患者，用于诊断HCC的特异度为26%，敏感度为92.5%。OPN与HCC大小、临床分期、有无肝内外转移及癌栓等密切相关，其对于HCC的预后判断及术后复发转移的预测也有重要意义。
SF主要在肝脏合成，以维持体内铁的供应和血红蛋白的相对稳定。目前认为SF的测定可以作为HCC辅助诊断及疗效监控和预后判断的手段之一，特别是对于AFP阴性的患者尤有意义，但其特异度较低。
CD166是免疫群蛋白超级家族的细胞表面构件，其表达被视为有价值肿瘤指标，与HCC疾病进展情况、疾病预后有一定联系。CD166是一种精确的血清标志物，用于肝癌的诊断和复发监测，灵敏度和特异性高于AFP。
细胞因子类
研究发现HCC患者血清TGFβ1和TGFβ1mRNA水平均明显高于正常对照组和肝脏良性疾病对照组。但由于TGFβ1在肝外肿瘤、伤口愈合、血管再生和纤维化中均会升高，从而导致其特异度降低。
血液中的IGF-Ⅱ主要由肝脏合成。研究表明IGF-Ⅱ与HCC的发生发展密切相关。HCC患者血清中IGF-Ⅱ明显升高，其对HCC有一定的辅助诊断、预后判断价值。
HGF的检测对HCC早期诊断、疗效观察及预后判断均有一定意义。但是，除了HCC之外，其他疾病也可表现为HGF水平的升高，包括食管鳞癌、淋巴瘤、冠脉综合征、主动脉夹层、肺血栓栓塞、脑梗死及败血症等。因此，需要进一步的研究来探讨炎性改变和恶性肿瘤二者与HGF浓度升高程度的相关性。
TSGF是一种在肿瘤生长时由肿瘤细胞及周边血管产生的物质。TSGF可用于早期HCC诊断，且在监测疗效、转移及复发中也有一定应用价值。有研究报道TSGF用于HCC检测的敏感度为82.4%，特异度为75.3%，其与AFP、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)和IL-8联合检测的敏感度和特异度均可达100%。
酶类标志物
DCP是一种维生素K缺乏所致的异常凝血酶原蛋白，在恶性肿瘤细胞中由于凝血酶原前体翻译后羧基化缺陷而产生。其敏感度和特异度可达86%和93%，明显优于AFP和AFP-L3，被日本、韩国及印度批准作为HCC的有效标志物，尤其是判断肝内转移和预后。
有研究报道AFU用于诊断HCC的敏感度为72.4%，特异度为63.8%。但AFU在糖尿病、胰腺炎、甲状腺功能减低症时也会有一定程度的升高。因此，AFU对HCC的早期诊断特异度不高，需与其他肿瘤标志物联合检测才能有效对HCC进行准确检测。
有临床资料表明GGT是诊断HCC的敏感指标之一，对HCC的早期诊断有一定的意义；GGT升高幅度与癌组织大小及范围有关，动态观察可监测疗效、判断预后。
有研究发现HCC患者血清MMP1水平明显升高，MMP是肿瘤发展微环境中改变的主要介质，可以作为早期诊断HCC的生物学标志物。MMP1从肝硬化患者中区分出HCC患者的敏感度和特异度比AFP和OPN高，MMP1能准确辨别AFP水平低于20 ng/ml的HCC。
抗体和抗原类
SCCA是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一员，在HCC患者组织和血清中SCCA过度表达。研究发现血清SCCA诊断HCC的敏感度为18%～84%，特异度为27%～73%，而血清SCCA-IgM可能是诊断HCC更加有希望的生物标志物。
常用于HCC诊断的抗原还有CEA、CA19-9、CA12-5、CA50、CA15-3等，但检测单个抗原对HCC诊断的特异度较低，多个抗原抗体的组合检测可能会提高HCC的诊断效率。
循环基因和细胞类标志物
循环标志物由于便于获取而成为HCC预后判断的首选标志物。HCC患者的外周血循环遗传标志物如AFPmRNA、TGFβ1mRNA和IGF-ⅡmRNA等用于监测远端转移或HCC术后复发。
CTC已作为预测肿瘤复发和转移有前途的候选标志物。有研究表明上皮细胞黏附分子阳性CTC可作为肝癌术后的预后指标，但它们的临床有效性依然需要验证。
HCCR主要在肝癌细胞的质膜和胞浆中表达，正常组织为阴性；在从肝硬化到HCC的疾病进程中，HCCR作为诊断标志物优于AFP，尤其是诊断早期HCC及小肝癌患者。此外，有研究显示HCCR的过量表达与HCC的早期发生关系密切，并且与HCC的侵袭和转移有一定的关系，HCCR在低分化肝癌细胞中表达明显高于高分化肝癌细胞。
AFP-mRNA源于脱落入血的HCC细胞，可在HCC患者外周血清中检测到，可作为HCC的血清肿瘤标志物。AFP-mRNA可用于HCC早期转移的诊断，且其特异性极高，可有效排除假阳性患者。
P53是一个重要的抗癌基因，其与细胞周期的调控、修复、细胞分化、细胞凋亡等生物学功能有关，功能异常可导致细胞生长异常。HCC患者最常见为P53突变，P53通过影响beta-catenin信号通路发挥对EMT的调控作用，降低P53表达能够促进betacatenin的细胞核内积累及转录活性，抑制beta-catenin信号通路可减弱P53降低所促进的肝癌细胞EMT、细胞迁移和肿瘤转移，其P53突变预示较差的预后。
SALL4在HCC细胞的阳性率为81.67%，显著高于癌旁组织的25%，此外SALL4高表达患者的3年生存率低于SALL4低表达者。因而SALL4与HCC有着密切的临床联系，对判断患者预后有一定临床价值。
CDH17是钙黏蛋白超家族的新成员，在正常组织中，CDH17的表达局限于小肠和结肠的上皮细胞；其参与细胞间识别、粘附过程，在组织发育维持形态有不可替代的功能。CDH17是诊断消化系统腺癌的有用的免疫组织化学标记。
■ 肿瘤标志物对HCC的诊断起着至关重要的作用，特别是对于早期无症状的微灶肿瘤，影像学无法发现时，肿瘤标志物的异常起着重要的参考价值。
■ 虽然AFP仍然应用非常广泛，但是更多的时候是通过与其他肿瘤标志物联合使用。通过联合检测肿瘤标志物能在早期，甚至在更早期进行诊断肝癌，从而进行更早的干预，这对于提高患者的生存率、改善患者的预后有重要意义。
■ 肿瘤标志物的联合检测已经成为临床工作中的趋势，但是在不同地区、不同医院，联合检测的项目仍然不同，到底哪一种联合检测既能兼顾患者的经济利益，又能提高诊断效果，目前仍然没有统一结论。
参考文献：
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肝癌检测还在依赖甲胎蛋白？ 中国技术有了更精准方式
近日，中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授与美国加州大学圣地亚哥分校 Kang Zhang（张康）教授团队的合作论文「Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma」在自然出版集团旗下 Nature Materials（影响因子 39.737 ）在线发表。
这项中美合作研究发现，通过检测少量（4~5ml）外周血中循环肿瘤DNA（ctDNA）特定位点的甲基化水平，可以对肝癌进行准确的早期诊断及疗效和预后预测。
这一成果可望打破肝癌长期单一依赖甲胎蛋白（AFP）检测的困境，提供全新的高灵敏度的检测标志物。
研究论文截图
如何检测肿瘤？
抽血实现，无创、实时、全面、准确
研究发现，肿瘤患者外周血中可检测到肿瘤细胞坏死、凋亡所释放的 ctDNA，由于其携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变，理论上可以利用 ctDNA 对肿瘤进行诊断。
与经典的组织活检技术相比，液体活检技术具有以下优点：
无创性，仅凭少量外周血标本即可完成检测，不会引起肿瘤播散；
实时性，可动态反应肿瘤细胞的遗传改变和演变进程，避免反复有创的组织活检；
全面性，反映的是体内肿瘤细胞的分子遗传信息的全貌，避免了瘤内异质性对组织活检结果的影响；
准确性，其所携带的分子遗传学信息来自原发肿瘤，具有高度敏感性和特异性。
如何测出肿瘤？
ctDNA 甲基化，肿瘤液体活检新靶标
在最近发表的这项成果中，研究者选择了 ctDNA 甲基化， 作为液体活检的靶标。
DNA 甲基化是 DNA 重要的修饰途径之一，在 DNA 甲基化转移酶( Dnmt )作用下将甲基选择性添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的过程，可调控基因的表达。
研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞基因组的整体甲基化水平降低，抑癌基因启动子 CpG 岛甲基化水平升高。在同一类型的肿瘤细胞中可检测到稳定和一致的特征性 DNA 甲基化改变，DNA 甲基化作为肿瘤发生过程中的早期分子事件之一，常导致相应的抑癌基因失活，因此可作为潜在的肿瘤早期诊断的理想标志物。
但是，ctDNA 在血液中的含量极微，每毫升血中仅有约 20ng ，且混杂在更大量的正常游离 DNA 背景中，在如此微量的 ctDNA 中检测单个碱基的甲基化水平存在很多困难。
在这项新发表的工作中，研究者先后攻克了稳定提取微量 ctDNA 、提高重亚硫酸盐转化效率、靶向甲基化 PCR 扩增及测序、海量数据的统计学分析处理等多个技术壁垒，成功地在肝癌患者中实现了检测 ctDNA 甲基化作为早诊和随访及预后预测标志物的目标。
检测准确度如何？
敏感性和特异性明显高于现有肝癌血清标志物
研究者首先在全基因组水平上从肝癌组织和正常血液 DNA 的 4 85,000 个 CpG 位点甲基化中筛选出差异性最显著的位点；设计相应的锁式探针（ Padlock probe ），对近两千例肝癌和正常人血浆中提取的微量 ctDNA 进行了甲基化 PCR 扩增和测序。
确定了这些位点的甲基化水平后，通过大量的统计学分析和计算，并利用多种人工智能模拟的机器学习方法，最后分别筛选出 10 个和 8 个位点建立了诊断模型和生存预后模型。
该诊断模型在训练组 715 例肝癌患者和 560 例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了 85.7% 和 94.3% ，在验证组 383 例肝癌患者和 275 例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了 83.3% 和 90.5% ，均明显高于现有肝癌血清标志物 AFP ，并能准确区分肝癌患者和慢性肝炎（ HBV/HCV ）和脂肪肝患者，显示出在肝癌早期诊断中的巨大价值。
此外，该模型还能准确反映肝癌患者的 TNM 分期、体内有无肿瘤残留、对治疗的反应以及有无复发等。而对 1049 例生存资料完整的肝癌患者，依据生存预后模型进行评分，低风险组患者的预后显著优于高风险组患者，显示出利用该模型可以准确预测肝癌患者的预后，有利于对不同的风险的患者进行更为个体化的治疗。
ctDNA 甲基化诊断模型在训练组（左）和验证组（右）人群中的诊断敏感性和特异性
用于构建诊断模型10个CpG位点在训练组（左）验证组（右）患者ctDNA中的甲基化水平Heatmap图
ctDNA 甲基化诊断模型诊断肝癌的 AUC（0.969）显著优于 AFP（0.816）
训练组 680 例（左）验证组 369 例（右）不同生存风险评分的患者预后具有显著差异
我国是肝癌大国，全世界每年超过一半的新发肝癌病例都在中国。甄选高灵敏度的早诊和随访标志物对于提升肝癌整体疗效意义重大。
ctDNA 甲基化液体活检技术的成功，标志着我国在液体活检这一最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段领域已经与国际比肩，我们期待这一技术尽早推向临床，造福广大肝癌患者，尤其是亚临床期的早期肝癌患者。
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