这是《肠道产业》第 148 篇文章
抗生素耐药性是一场愈演愈烈的全球危机，它给公共健康、社会和经济都造成了重大负担。噬菌体疗法是一种尚在开发阶段的抗生素治疗替代疗法，通过噬菌体感染并杀死多重抗药（MDR）细菌达到治疗目的。该疗法目前面临的主要挑战在于噬菌体的高度感染特异性限制了它们对于不同菌株的感染能力。而合成生物学可以设计、修饰和合成具有更好抗菌表现和功效的噬菌体，以实现治疗细菌感染性疾病的目的，其中包括多重抗药病原体引起的疾病。今天，我们特别编译了发布在 Genetic Engineering & Biotechnology News 杂志上关于噬菌体疗法的文章，并补充了噬菌体疗法在肠道疾病上的应用等内容。希望通过此文能够让各位读者对噬菌体疗法有一个更为全面的了解，同时为产业人士在解决相关难题上提供一些启示。在 20 世纪 40 年代，大量使用抗生素之前，很多感染性疾病都是致命的，而如今利用常规抗生素治疗方法便可治愈。抗生素的问世无疑为解决微生物引起的传染性疾病提供了有力武器，不过现在却可能成为了导致人类死亡的主要原因。随着对现有抗生素产生耐药性的致病菌数量迅速增加，致病菌的耐药性（AMR）已经成为一个日益严重的全球性问题，并给临床和公共卫生带来巨大负担。世界卫生组织预测，截止到 2050 年，如果没有良好的抗生素治疗替代方法，抗生素耐药性将会造成全球 100 万亿美元的损失和每年多达 1000 万的死亡人数，这将远超每年患癌症和心脏病的人数1。多重抗药细菌通过多种抗药性保护自己不受抗生素的侵害，尤其当微生物处于生物膜中时，不同耐药机制可以协同作用增强细菌耐药性2。生物膜是指被微生物分泌的细胞外基质包裹的细菌群体。病原菌生物膜可形成稳定的三维结构保护病原菌免受宿主免疫系统和抗生素的攻击。此外，生物膜中致密的群落结构增加了细菌间水平基因转移的效率，从而增强了抗生素抗性基因的传递。因此，生物膜是治疗后所要面临的在临床环境中的主要挑战，也是目前抗生素治疗中的一个主要盲区。
全球性多重抗药致病菌的爆发驱动着科学家对抗生素替代品的研究。噬菌体疗法作为一种抗生素替代疗法，通过利用噬菌体侵染和杀死致病菌以达到治疗疾病的目的3。此前，该方法一直被西方医学忽视，现在，噬菌体疗法的复兴备受期待。最近一些研究案例证实了噬菌体疗法的安全性和有效性，这引起了社会媒体的广泛关注。不过，该疗法仍需要进一步的深入研究和严格的临床试验。噬菌体治疗是一种在作用机制和细菌裂解动力学原理上与抗生素治疗截然不同的治疗方法。
图片来源：Phage Therapy: A Renewed Approach to CombatAntibiotic-Resistant Bacteria
噬菌体依靠宿主细胞机制进行自主性自我扩增，在感染过程中产生的噬菌体后代与目标细胞结合，并进一步裂解目标细胞。噬菌体可以感染不同种类的细菌：有些噬菌体只能感染单一或少量菌株，有些则能感染不同属的细菌。这些差异是由目标细胞表面存在的特异性噬菌体受体决定的。因此，噬菌体具有以下特性：（1）较高的靶向特异性；（2）较低的细胞裂解后内毒素生成；（3）穿透生物膜的能力等优势。这些特性让噬菌体疗法可以降低肠道菌群紊乱等不良副作用的风险。许多噬菌体已进化出生物膜降解酶，能够增强渗透和接近生物膜内的细菌宿主的能力。此外，由于噬菌体和抗生素耐药性之间的进化平衡，针对这些靶向细菌抗生素耐药性机制（例如，外排泵）的噬菌体，细菌会产生抗性，这一过程可使细菌对抗生素重新敏感，从而为协同治疗提供了令人兴奋的可能性4.5。
肠道菌群在多种胃肠道疾病的发病机制中起重要作用。其组成是由宿主-微生物菌群和微生物菌群相互作用共同形成，而噬菌体作为以细菌为目标的病毒，具有调节菌群的潜力。在胃肠道方面，目前，噬菌体疗法主要用于研究治疗霍乱等传染病，也被用于艰难梭状芽胞杆菌结肠炎、附着-侵入型大肠杆菌克罗恩病以及具核梭杆菌导致的结直肠癌等肠道疾病的治疗研究中。噬菌体疗法治疗克罗恩病的试验也正在研究中。图片来源：Phage Therapy with a Focus on the Human Microbiota
虽然噬菌体疗法具有巨大潜力，且已经被用于部分疾病的治疗，但是其发展仍面临诸多障碍，主要有以下几个方面：噬菌体的靶向特异性 噬菌体比窄谱抗生素的靶向范围更窄，因此，在选择噬菌体之前，需要对目标菌种或菌株进行培养和识别。众所周知，感染早期给药比晚期给药会产生更积极的治疗结果，所以如何快速确定噬菌体，提高时间效率会成为噬菌体治疗疾病的关键。此外，细菌细胞有多种方式来抵抗噬菌体，比如噬菌体受体的突变、 CRISPR/Cas 和限制性内切酶修饰系统的激活以及胞外多糖的产生等6.7。基于这些考虑，有效的噬菌体治疗可能需要含有至少 2 种噬菌体的噬菌体混合物。开发良好协作的噬菌体组合 寻找一组对系列致病菌有效的噬菌体，并让它们良好的协同合作是十分困难的。由于许多噬菌体是溶原性的（与宿主菌基因组整合后，通常不增值、裂解）而非纯粹的溶菌性，所以很多具有理想的靶向特性的噬菌体不具有用于噬菌体治疗的资格。溶原性噬菌体被取消治疗资格的原因主要是：第一，感染周期不可预知，无法预测何时导致细胞溶解；第二，可以整合到宿主基因组中编码毒性因子（例如，毒素）；第三，可保护宿主免受其他噬菌体的侵染；第四，生命周期特性倾向于基因水平转移。
知识产权（IP）的保护 阻碍噬菌体治疗药物广泛发展的另一个障碍是知识产权（IP）保护问题。由于与那些从自然界分离出来的噬菌体相同的噬菌体是不可申请专利的材料。因此必须设计出保护该疗法知识产权的其他方法，否则将永远无法获得通过监管程序的资金。通过生物工程方法创造的新型噬菌体也许能够克服文章前面提到的发展障碍。比如，溶原性噬菌体可以被改造成溶菌性噬菌体8。也可以通过尾部纤维修饰来改变噬菌体的靶向特异性9。又或者，为噬菌体装载增强生物膜降解的酶8。重要的是，噬菌体工程在大多数司法管辖区是可申请专利的，因为它们涉及人工合成序列并且其设计创造过程是具有创造性的。例如，美国最近批准了专利编号为 US 10174,295 的“组成：（Composition of matter）大肠杆菌噬菌体 K1E”。该专利保护了几种不同的可用于诊断的噬菌体核苷酸序列，它们通过确定菌株是否具有 K1 包膜来确定样品中的抗生素敏感性。人们普遍认为，“组成”是最多申请的专利类型之一。开发用于噬菌体治疗的噬菌体工程技术的尴尬现状在于目前几乎没有工程噬菌体被制造出来，更不用说被引入人体或其他动物体内了。现在急需一种以高通量制造和测试工程噬菌体的方法去确定该伟大构想是否能够实现。
另外，制造复合噬菌体或许是开发良好协作的噬菌体组合的替代方法。因为噬菌体基因组具有可互换的模块的镶嵌结构，可以通过结构再造达到理想的抗菌表现。噬菌体基因组可以组合来自不同噬菌体组的不同部分，然后在体外的基因组支架上进行组装，最后在一个明确的细菌宿主内“重启”合成基因组9。然而，大规模开发一个快速、可靠、高通量的噬菌体工程平台目前才刚刚开始尝试8。为了攻克生物膜堡垒，可通过噬菌体设计实现生物膜胞外多糖降解等特定功能。例如，T7 和 Y2 噬菌体是利用 dspB 和 dpoL1 编码的酶实现降解胞外多糖的。由于能够破坏生物膜基质并使埋藏的细胞暴露，工程噬菌体因此表现出更强的生物膜内的细胞裂解能力6。重要的是，噬菌体受体结合基因可以进行交换，从而使得工程噬菌体具有更大的宿主适用范围，包括跨属的噬菌体9。目前大规模部署噬菌体工程的一个主要障碍是设计、构建和测试方法不够完善，与筛选天然噬菌体对抗易感宿主相比，这是十分耗费人力、物力和金钱的。所以，急需一种新的噬菌体生物工程模式来提高产量和标准化水平。
新的尖端设施 Biofoundry或可作为一种新方法，以解决当前工程噬菌体生产模式“设计-建造-试验-学习（DBTL）周期”的低效问题（如下面图1）。
Biofoundry 是一种配备完全自动化设备、相关软件、标准化工作流程和专门技术人员的核心设施，旨在通过专业的编程手段和标准化实验室操作生产基因重组的生物。Biofoundry 拥有精确的基因设计软件、自动化液体处理和菌落（或菌斑）挑选机器人等尖端技术，可以提高合成生物技术的产出效率。此外，Biofoundry 实现了自动化的高通量实验室方法，提高了运行效率和可重复性，研究人员可以专注于实验设计和数据分析等任务。DBTL 周期的一个关键部分是其迭代过程，通过结合专业设备，可实现对每个循环过程进行全自动化改进。目前，全球共有 16 个 Biofoundry，大部分位于英国和美国，还有两个在造的在澳大利亚，分别由澳大利亚麦考瑞大学成立，和联邦科学与工业研究组织（CSIRO）与昆士兰大学联合成立。2019 年 5 月，全球生物代工厂联盟（Global Biofoundry Alliance）在日本神户正式成立，包括 16 家成员单位，其中 2 家来自中国，分别是中国科学院深圳先进技术研究院和天津大学合成生物学前沿科学中心10。该联盟计划将 Biofoundry 作为基础设施提供给科研和产业机构。尽管在此之前 Biofoundry 未并被用于设计和测试工程噬菌体，但是这一前沿技术表现出了明显的优势。利用 Biofoundry 进行噬菌体工作的优势在于：（1）可进行纳米级不同噬菌体文库的组装；（2）可测试噬菌体对不同细菌宿主的效力；（3）可进行高通量抗菌测定。利用 Biofoundry 可以获得研究标准化结果，鉴定噬菌体靶向宿主的遗传基础，完成 DBTL 合成生物学工程循环。另外，在整个 DBTL 过程中，每个工程噬菌体变体都会被锁定并被追踪，从而实现良好的实验室实践/生产规范（GLP / GMP）法规遵从性（下图）。Biofoundry 进一步的体外测试，如人类肠道的微流体模型，将加速噬菌体识别用于体内临床试验的步伐（下图）。
图1 噬菌体生物工程的“设计-建造-试验-学习”循环强调了这一过程中每个阶段的关键步骤。噬菌体基因组是在硅材料中设计的，并利用一种酵母重组的方法在生物合成设施中构建。
工程噬菌体的测试是在体外进行的（例如，使用微流体），根据获得的数据，通过迭代学习循环进行重新设计和改进。由此产生的噬菌体可以进一步进行动物试验和临床测试。
多重抗药致病菌是全球人类生命的新兴威胁。与传统的小分子疗法相比，工程噬菌体的攻击途径是直接的，因此，工程噬菌体疗法在治疗高耐药病原体方面具有重要的应用前景。由于构建强感染性的噬菌体需要耗费高昂且低效，因此难以产生显著的临床影响。Biofoundry 下建立的高通量噬菌体工程技术可推动临床级噬菌体库的实现，这对于治疗全球最严重的 AMR 疾病意义深远。（滑动下方文字查看）
1.O’Neill J. Review on AntimicrobialResistance. Tackling Drug-Resistant Infections Globally: Final Report and Re-commendations. London, England; 2016.2.Hall CW, Mah TF. Molecularmechanisms of biofilm-based antibiotic resistance and tolerance in pathogenicbacteria. FEMS Microbiol Rev. 2017;41:276–301.3.Gordillo Altamirano FL, Barr JJ.Phage therapy in the post- antibiotic era. Clin Microbiol Rev 2019;32:pii:e00066-18.4.Looft T, Allen HK. Collateraleffects of antibiotics on mam- malian gut microbiomes. Gut Microbes.2012;3:463–467.5.Chan BK, Sistrom M, Wertz JE, et al.Phage selection re- stores antibiotic sensitivity in MDR Pseudomonas aerugi-nosa. Sci Rep. 2016;6:26717.6.Kilcher S, Loessner MJ. Engineeringbacteriophages as versatile biologics. Trends Microbiol. 2019;27:355–367.7.Labrie SJ, Samson JE, Moineau S.Bacteriophage resis- tance mechanisms. Nat Rev Microbiol. 2010;8:317–327.8.Lemire S, Yehl KM, Lu TK.Phage-based applications in synthetic biology. Annu Rev Virol. 2018;5:453–476.9.Ando H, Lemire S, Pires DP, et al.Engineering modular viral scaffolds for targeted bacterial population editing.Cell Syst. 2015;1:187–196.10.Hillson N, Caddick M, Cai Y, et al.Building a global alliance of biofoundries. Nat Commun. 2019;10:2040.11.噬菌体疗法：https://www.genengnews.com/insights/building-better-bacteriophage-with-biofoundries-to-combat-antibiotic-resistant-bacteria/12.噬菌体在肠道方面的进展：SabinoJ, Hirten R P, Colombel J F. bacteriophages in gastroenterology—from biology toclinical applications[J]. Alimentary pharmacology & therapeutics, 2019.
作者：Karen D. Weynberg,PhD and Paul R. Jaschke, PhD