微生物组是一个复杂的微生物群落，其中的微生物成员之间存在复杂的相互作用。为了解析微生物组的复杂性，当前涌现出了越来越多的新技术和新手段。今天，我们特别编译发表在 Nature Method 杂志上题为“Engineers embrace microbiome messiness”的文章。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。微生物组是活跃的、不断进化的、复杂的微生物群落，它们在空间上和时间上都是动态变化的1。哥伦比亚大学欧文医学中心的研究员 Harris Wang 说，为了应对这种复杂性，他的实验室的理念是“坦然接纳自然环境中的混乱”，因为这有助于研发出能够适应这种复杂变化的工程技术。哈佛大学 Wyss 生物启发工程研究所所长 Don Ingber 说：“微生物组在健康和疾病中的重要作用已经使医学发生了改变，但是，目前我们对微生物组功能的所有认知都是基于基因组。”劳伦斯伯克利国家实验室的研究员 Trent Northen，目前负责主持美国能源部联合基因组研究所的几个研究项目。Northen 说：“大多数对于微生物基因功能的认知来自于对微生物单独分离研究，但是，众所周知，微生物在自然界很少单独存在。也许正是因为研究人员对单一菌株的关注导致了对很多微生物基因功能缺乏理解，因此，我们迫切地需要用更生态学的方式来理解群落中工程菌的基因、代谢产物和代谢通路。微生物组工程可以帮助实验室验证和改进他们对微生物组的理解，它可以帮助我们应对诸如肠易激综合征（IBS）等情况，提供环境微生物修复方案或更好地探寻微生物在生态系统中的角色。实验室虽然不是专业的微生物组设计工作室，但通过优化推进建模和探索微生物群落可以使我们朝着这个目标迈进。”科罗拉多州立大学的 Kelly Wrighton 说：“我的实验室是‘生态系统不可知论派’，目前团队的主要研究方向是微生物生态系统，包括土壤环境、页岩环境以及肠道。通过追踪各生态系统的代谢机制，尤其是厌氧环境中的微生物代谢，对由于物理空间或微生物互作产生的抑制、进程及变化作用进行探究。现在，实验室可以通过对基因组和菌株的解析来更好地挖掘微生物群落的代谢潜力。” 他们对整个生态系统中的微生物所提供的功能进行探索挖掘，发现不只是肠道，在整个地球中的各生态系统中，微生物都存在类似的功能特性。Wrighton 的研究团队借助合成群落，剖析生态系统的复杂性，对其进行跟踪和监测，并获得时间动态解析数据。Wrighton 说：“理想情况下，我们能够将实验获得的信息在真实环境中得到验证。例如，我们目前研究的是地表以下 2500 米的页岩油气井。为了释放天然气，高压将水和化学物质泵入地下。因此，在破裂之前，岩石中几乎没有生命和水，它们是‘古氏巴氏灭菌（paleopasteurized）’过的。但是压裂过程中会引入可以形成生物膜的微生物，并对井造成腐蚀性‘酸化’。”她通过研究这些反应来了解微生物组的代谢过程，同时也着眼于可能的应对策略。实验室模型和代谢分析结果显示，在这一深度中，存在着一个重要的微生物代谢网络——氨基酸的协同发酵2。例如，在页岩油气井中富含的一种氨基酸衍生物甜菜碱。而根据微生物群落中盐厌氧菌属（Halanaerobium）、地袍菌属（Geotoga）和甲烷嗜盐菌属（Methanohalophilus）的丰度，可以预测这些页岩中碳和氮的有效性。基于此，科学家们在实验室中重建了页岩微生物群落的“微观世界”，可以产生 75%左右自然环境下循环的碳和氮。Wrighton 说：“对我来说，那是我第一次意识到真实世界与实验室之间的关联。”研究人员还对页岩、土壤和人类肠道中的甲胺循环进行了分析。研究小组在页岩上的经验让他们以此类推获得了对肠道的更多认知。“这不仅仅是建立一个系统中的某个代谢网络。我们还在研究酶、有机体以及微生物的互作关系，以及不同生态系统中的竞争情况。” Wrighton 说。有时实验室结果并不适用于现实环境。Wrighton 说：“模拟的土壤微生物甲烷产生过程在实验室中可以得到漂亮的结果。我们通过基因组分析发现了产生甲烷的关键菌株，进而我们在实地环境中寻找这些关键菌株，但事实是，这些菌株并不在土壤中。实验室建模有助于揭开谜底、探究因果关系、进而缩小目标范围，但是实地应用却是另外一番景象，它给我们提供的是真实的背景信息。”
图.在 EcoFABs 中，植物生长在一个量身定制的根际微生物群中。
Northen 和他的团队建立的 EcoFABs 系统用于透彻分析已知的微生物生态系统模型。（编者注：EcoFABs 由确定的微生物群落结构、实验室模拟栖息地、培养方法和时空分析组成。一旦完成模型标准化和数据上传，就可实现多实验室的合作-调整-机制研究，为理论学说和预测模型的建立提供支持）EcoFABs 的一项研究案例是关于根际微生物组的研究。在 3D 打印模具中，用水培养幼苗，并在模具中加入不同的微生物。利用质谱等方法来捕获根际微生物的代谢与物质交换情况。Northen 说：“该系统需确保从无菌环境开始，以保证研究的准确性。然后，就可以预测代谢物交换，继续设计以及测试合成微生物组。目前，EcoFABs 还处于起步阶段，但是它能够作为‘设计-建造-测试-学习’迭代循环的一部分。大规模的微生物体外代谢物分析将为开发标准化模型提供数据支持。”该团队计划为 EcoFABs 增加单细胞成像功能，利用多色荧光成像技术，构建报告因子，并应用荧光环境敏感探针进行空间分析，进而表征微环境下的微生物。Northen 说：“这些系统可以帮助解决一系列开放性问题：植物是否通过调节根际分泌物筛选有益菌？这种筛选过程是否会随着环境条件改变而改变？如果有，那么这些微生物对植物的功能是什么？根际微生物之间相互依赖的程度如何?” Northen 建议在设计合成微生物组时，慎重选择微生物组组成菌株。如果研究人员是根据系统发育树进行选择的，那么他们需要注意这些微生物的亲缘关系。他们也可以根据微生物的功能来进行选择。Northen 表示：“其实我们对于土壤微生物群落的思考还很片面。微生物群落如此多样，实验室水平上进行微生物活动和相互作用方面的研究能力还十分有限，尤其是在大规模研究方面。”为了加强合作效果，Northen 希望该研究人员能重点集中研究几个具有互补性的实验室生态系统，这样更有利于完善生态系统模型3。Northen 表示：“这类似于就模式菌株得到一致意见一样，希望我们这个模式生态系统模型进度可以更快一点。EcoFABs 指导委员会（EcoFAB Steering Committee）可以负责组织联系。”加利福尼亚大学圣塔芭芭拉分校 Michelle O’Malley 说：“我们进入了一个新奇微观世界，在那里微生物负责很酷的化学反应。” O’Malley 主要从事厌氧菌研究，包括肠道、垃圾填埋场以及缺氧海洋沉积物的微生物组。瘤胃就是这样一种“新奇”的栖息地，山羊吃多吃少都要归功于瘤胃。瘤胃是反刍动物的第一胃，是迄今已知的降解纤维物质能力最强的天然厌氧发酵罐。反刍时，食糜逆呕至口腔重新咀嚼。研究瘤胃微生物组的经验教训指导着实验室构建一个可以处理各种食物的最小微生物生态系统。为了探究微生物之间的互作，研究人员对微生物群落中成员的基因组进行了编辑，并且探究了微生物丰度和代谢活性的变化。通过基因编辑技术，研究人员能够显示哪些微生物吃糖、降解纤维、制造短链脂肪酸或产生甲烷。 O’Malley 说：“在测试微生物如何互作、碳是如何循环的以及建模的最佳条件是什么上，仍然存在研究空白。在我看来，人们现在对肠道微生物组认知大多数都只是猜测。应进行微生物菌株水平研究，而不是在存在冗余的群落水平进行研究。尽管我作为一名工程师为此感到挣扎，但冗余的存在对微生物群落来说是情有可原的，功能性冗余将有助于微生物从群落失调中恢复平衡。”O’Malley 的实验室利用基因组编辑工具来控制微生物群落中的不同成员，但是她发现 CRISPR-Cas 基因编辑技术并不能对所有微生物产生同样的效果。该团队还开发了改造微生物组环境的“塑造微生物群落（sculpt microbiomes）”法（如通过限制营养或仅促进某些成员的生长）。O’Malley 实验室使用的工具技术从 1950 年代的培养基富集法（特定培养基用于促进某些特定微生物生长）到新兴技术（如 RNA 测序，基因编辑、从头组装、代谢分析和建模），应有尽有。许多微生物组研究实验室只专注于细菌，但 O’Malley 认为这存在偏好风险，她说：“DNA 提取会使捕获到的基因特征产生偏差，因为有些方法更适用于细菌，而有些方法则更适用于真菌或古菌。实际上，单就样品收集、样本制备以及样品稳定性，我们就会进行大量的优化实验，以便我们能够获得最真实的信息，知道究竟存在哪些微生物。”正是这种观点帮助研究团队发现，由于厌氧真菌的影响，食草动物比其他任何被测序的生物拥有更多的降解酶4。这个结果是令人惊讶的。瘤胃中的真菌通常被视为病原体或者由于采样偏差而被忽略，研究人员通常将草食性动物瘤胃液作为样品，其中富含细菌，但也含有少量的真菌。O’Malley 表示，这些真菌主要与食物颗粒有关，通常在样品制备阶段被丢弃。正在进行的一项使用纤维类食物喂养灵长动物（包括黑猩猩和大猩猩）的研究表明，它们在消化道中有丰富的真菌，这一发现为人类肠道研究提供了灵感。
图.在肠道微芯片中，人类的肠道微生物群与肠道细胞直接接触。
Ingber 和他的研究团队发明构建了一套可以进行肠道上皮细胞体外培养的设备，该模拟肠道具有肠道上皮细胞，细胞外有液体流动（模拟肠道生理环境），并且具有肠道蠕动的特性。Ingber 说：“我们课题组对该模型进行了进一步升级，现在实验室可以用该模型研究与人类肠道细胞及其上层粘液直接接触的复杂人类肠道微生物组5。在人体肠道中，含氧的血液流经毛细血管，当穿过肠道上皮细胞组织界面进入内腔时，氧气的浓度会逐渐降低。因此，该模型具有两个通道，一条通道含氧，另一条则不含氧气。这种肠道模型微芯片可以维持一个超过 200 种细菌的复杂人类肠道微生物组，其中包含厌氧菌和需氧菌。”Ingber 和他的团队还模拟对比了人和小鼠对肠出血性大肠杆菌的感染敏感性差异，发现这很大程度上取决于肠道微生物代谢产物。Ingber 说：“类器官对于研究细胞分化和基础细胞生物学问题确实是很有价值的，但是它们往往是组织，而我们的模型更像是芯片器官，可以进入肠腔和毛细血管腔。类器官是封闭的球体。因此，你无法控制其中的条件，而这些漏洞终将会置人于死地。”几年前，他着手构建一种肠道芯片，以探索在受控条件下人类宿主-微生物组间的相互作用。正常的人类肠道微生物组包括许多专性厌氧菌和需氧菌，这使得在实验上极具挑战性：需氧菌不喜欢低浓度氧气环境，反之亦然，而且非常低的氧气浓度会杀死人类细胞。Ingber 说：“这就是问题所在。”哥伦比亚大学的 Wang 评论该系统说：“这是一种非常优雅的研究微生物组的方式。但仍然缺少某些组分，例如免疫系统。” Northen 说：“我对这些类型的设备十分感兴趣，但是空谈不如实践，有影响力的研究才会被广泛接受。要推进此类工作，需要广泛的专业知识，如材料科学家、专注于微流控技术进行生态系统构建的专业人员。”Wang 说：“合成微生物群落存在的一个普遍性问题是，它们在复杂的环境中并不总是保持稳定。这些设计出来的系统对于理解微生物相互作用背后的调控机制以及关键驱动因素意义非凡。实验室可以利用它们来关注某些微生物的相互作用，不仅可以定性甚至可以进行定量研究。例如，特定环境中用于追踪代谢产物的研究系统。不过，如何推广到混乱的实际环境中是一个巨大的挑战，正如很难将一种被充分研究过的掠食者-猎物的关系推广到丛林生态系统一样。”Ingber 对新合成的大肠杆菌菌株很感兴趣，他说：“我们的模型可以用来推进这项工作。”这些新合成的大肠杆菌菌株是大肠杆菌 Syn61 的变种，是由在英国医学研究委员会分子生物学实验室 Jason Chin 的实验室合成的6。该研究小组利用 REXER 技术重建了大肠杆菌基因组（400 万个碱基对）。DNA 通过化学方法合成，然后进行组装，接着被运送到细菌中。研究小组将大肠杆菌的氨基酸遗传密码子数量从 64 个减少了到 61 个；两个丝氨酸密码子和一个终止密码子被替换。这是一种帮助合成生物学家构建生物体的方法，并非通过基因编辑就能轻易完成。正如研究人员 Benjamin Blunt 和 Tom Ellis 在 News and Views 中所指出的那样，这种大肠杆菌基因编码的合成与还原代表着“新档案（new records）”产生，类似的项目也在开展阶段。他们说：“基因组最小化和密码子减少只是这项新技术的首次应用，有朝一日，这项技术可能会为我们提供功能重组基因组和经特异修饰过的用于进行特定研究的基因组。”正如 Chin 解释的那样：“除了编辑单个基因组，实验室还可以使用这种方法来综合设计进化微生物群落。将不同程度遗传密码子减少的生物体组装成目标微生物群落，利用密码子优化限制微生物群落中生物体之间的基因水平转移。”麻省理工学院（MIT）研究员 Tami Lieberman 在她微生物组的研究工作中应用了进化方面的知识，她利用微生物累积的突变来预测评估细菌的个体进化自然史。Tami Lieberman 说：“基因适应性突变和相关的反应通路暗示了对细菌生存而言的最大挑战，并指引我们如何更好地消除或者增加这些细菌生存阻力。由于低频突变很难通过短读测序和组装捕获，我们实验室分开培养了特定的需氧菌株和厌氧菌株。这种培养方式避免了微生物竞争的同时又能反映体内环境中的多样性。”研究小组对许多单一菌落的基因组进行了高通量测序，这些细菌来自肿瘤、粪便或皮肤。Lieberman 实验室正在研究的项目之一是湿疹患者皮肤上金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的进化过程。金黄色葡萄球菌可能不是真正的致病原因，但是降低金黄色葡萄球菌水平可能会缓解病情。Lieberman 说：“除非出现大的干扰因素，如抗生素，否则个体中的微生物群落通常会保持在稳定状态。尽管大量暴露于环境中，但个体微生物群落似乎能够抵御这些外部压力。不过也可能存在其他可能性。”Lieberman 的实验室对健康个体肠道中的脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）进行了为期 18 个月的追踪。Lieberman 说：“我们发现，脆弱拟杆菌的功能性上存在一定的多样性，两种功能不同的脆弱拟杆菌可以共存。”O’Malley 说：“简而言之，微生物组工程师们应该在他们的工作中考虑到进化因素。在微生物群落中，非常相似的成员可能会突然分化。”O’Malley 和她的团队致力于触发此类事件，其中可能涉及基因水平转移，使得微生物具有竞争性或者适应性优势。她说：“如果能找到将其用于工程应用的方法，那将非常酷。”Wang 的实验室正是在进行此类工作。
图. 哥伦比亚大学 Wang 实验室开发了一种名为“MAGIC”的方法。
Wang 说：“虽然我们可以通过复杂的方式对微生物组进行分析，但缺乏操纵微生物组的工具。”他和他的团队构建了可应用于不同微生物组的通用方法，并希望它们能够成为“可被推广的种群规模的工程技术”。该方法名为 MAGIC，通过操纵移动基因元件在肠道中直接改变菌群7。具体地，利用大肠杆菌等菌株作为供体细菌，通过广谱细菌接合将模块化移动质粒（pGT）等基因操作元件转移入肠道菌群。Wang 说：“MAGIC 技术是用于研究混乱复杂的体内环境的工具之一，也是应对此类问题的工具库建立的开始。”Wang 实验室的博士后研究员 Carlotta Ronda 在与 Wang 一起接受采访时表示：“我们目前将该方法应用在肠道微生物组的研究中，但也可用于皮肤或者其它任何生境的微生物组。”MAGIC 能够对一个系统的组件去复杂化，进而获得对复杂的系统认知。研究团队利用了细菌之间遗传共享的特性（如，通过交换质粒或遗传元件）。Wang 说：“人们对这种特性的理解相当透彻，但并不了解它的应用范围。基因组分析揭示了基因的来源，这使基因组分析带有‘基因组考古学’的意味。共享元件只有在传递了优势时才会保留。例如，海洋细菌的基因转移到人体微生物群解释了为什么某些日本人可以消化原本无法消化的海藻多糖。基因水平转移没有那么常见，但仍不容忽视，特别是当涉及抗菌素耐药基因时。我们希望通过追踪转移事件发生网络，找到一种能够在‘友好接收者’中激活所需元件的方法。”Ronda 表示，实验室将继续优化 MAGIC 技术。载体需要具有稳定、可再编辑的特点。在尝试这种方法时，考虑到甲基化和调控元件会影响水平基因转移，实验室需要选择合适的质粒，以便他们可以针对特定目的调节构建体。Wang 说：“某种程度上来说，这些移动的遗传元件是自私的。它们试图尽可能多地在生物中繁殖。如果能将其应用于合成生物学，那便会成为一种不依赖单一载体就能植入新功能的方法。而且这些目的元件很有可能会被保留在整个群落中。” Wang 和他的团队已经建立了一个合成生态系统，在这一系统中，必需的代谢产物——氨基酸——被“交易”。Wang 说：“通过借鉴生物经济模型和‘微生物贸易’理论，可以定量地对物质交换相关的能量损失进行建模。但是将其扩展到具有空间异质性、时间可变性和环境波动的大型复杂群落却是一项挑战。工程微生物组意味着所设计系统需要既坚固又稳定。当这些条件无法保证时，模型就需要重新设计。”Ronda 说：“实验室刚刚开始研究自然的代谢能力，这可能会给发酵和可持续生产过程带来新思路。”另外，Wang 的课题组还在研究自然条件下基因水平转移的概率8。Wang 说：“我们借鉴了 CRISPR-Cas 间隔子（spacer）获取过程，该过程充当 DNA 记录器。当具备这种记录能力的菌株存在于微生物样品中时，入侵生物体的片段就会被其捕获并作为‘间隔子’整合到 CRISPR 序列中。而这些间隔子是具有保护性的，被转录后，它们成为细菌免疫系统的一部分。间隔子可以被测序以识别入侵生物体。这给予了研究人员灵感：将具有这种记录能力的菌株置于复杂的环境中，在该环境中，它将在其序列中记录轰击它的 DNA。利用这种方法，可以发现复杂环境中哪些微生物正在积极共享遗传信息，进而帮助实验室找到新型载体。具有记录能力的菌株可能是一个专用的基因转移系统，能够跟踪基因在不同生物体中的位置。”这是一个令人感到头痛的问题：对复杂的微生物系统进行建模是十分困难的，但是如果没有模型，研究就变得很困难。Northen 认为对“微生物群落的最佳猜测”涉及到循环往复验证整个模型的建立过程（构建-测试-发现漏洞-思考改进-建立新群落）。他说：“研究同一系统的越多，专业研究的多样性越多，我们对其认知就会越快。模型构建者需要明确他们的目标以及他们系统的适用范围。我们正在建立‘模式’生态系统，而不是‘自然’生态系统。这些模型必须具有可控制性和可重复性，这样科学家们才能够有效地确定因果机制，从而得出观点和适用模型。另外，模型的有效性和普遍性必须在自然生态系统中建立。”在比较实验室之间的工程微生物组时，‘天然’系统可以作为基准。那么，具体应该如何选择最靠谱的模型呢？Ingber 说：“这很简单，谁能更好地模仿人体生理学和临床结果，谁就可以取胜。”O’Malley 说：“有很多可以向大自然学习的东西。工程师倾向于过度简化模型系统，这可能不利于我们进行微生物组工程设计。我们需要思考的远比我们现在做的复杂得多。”为了应对微生物组的复杂性，微生物组研究人员需要开放合作。Ronda 说：“研究不同微生物组的实验室使用的研究方法不同，但都存在共同之处。微生物组学工程方法需要被推广，进而可以应用于土壤、植物根际、肠道等微生物组中。不同领域之间其实存在着很多共通之处。”在 Wrighton 的合作项目中， Wrighton 发现了共通的模式、共同的问题以及共享的资源。她说：“现在，这个领域是开放的。”参考文献：
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1. Baym, M. et al. Science 353, 1147–1151 (2016).
2. Borton, M. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, E6585–E6594 (2018).
3. Zengler, K. et al. Nat. Methods https://doi.org/10.1038/s41592-019-0465-0 (2019).
4. Solomon, K. V. et al. Science 351, 1192–1195 (2016).
5. Jalili-Firoozinezhad, S. et al. Nat. Biomed. Eng. https://doi.org/10.1038/s41551-019-0397-0 (2019).
6. Fredens, J. et al. Nature 569, 514–518 (2019).
7. Ronda, C. et al. Nat. Methods 2, 167–170 (2019).
8. Munck, C. et al. Preprint at https://www.biorxiv.org/ content/10.1101/492751v1 (2019).
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-019-0460-5