菌群特征怎么挖？肠菌采样注意啥？

这是《肠道产业》第 833 篇文章

编者按

自然界中，包括人类肠道菌群在内的大多数微生物，都以“混居”形式生存。即使采用实验室标准化培养技术进行细菌鉴定，也存在失败的可能，据了解，大约有 80% 的细菌无法通过标准化方法进行培养。因此，研究微生物多样性的最有效方法是采用非培养技术。

今天，我们共同关注肠道菌群表征技术，探讨采样、测序等方面不同技术的要点和优劣势。希望本文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

肠菌如何取样才正确？

一直以来，粪便都是研究肠道菌群的经典样本，然而，我们也应了解，胃肠道中不同区域的菌群是不相同的。例如，在研究低位肠常驻菌群时，粪便样本并非最可靠样本，尽管它是临床研究中最易获取的样本。

如果样品在采集后的 72 小时内无法置于- 80℃以下的环境中冷冻，也可能会出现系统偏差（最好是立即冷冻）。不过，如果采用 95% 乙醇和 RNAlater 等保存剂的话，那么样品可以在室温状态下稳定存放 7 天，在此期间微生物组成分不会发生明显改变。

此外，粪便不同区域的微生物也存在差异（例如：内部以厌氧菌居多，外部则以需氧菌居多），因此建议在提取 DNA 之前，先对样本进行均质化处理。

由于粪便样本存在个体差异，因此，为了能更好地表征肠道菌群的群体性特征，最佳方法是纳入更多的研究对象，并采用前瞻性的方式进行实验设计，以形成对照研究。

由于胃和小肠较难触及，菌群取样难度较大，而且高位肠段的菌群与低位肠段和粪便样本的菌群相比，存在较大差异，因此当前关于胃和小肠的肠道菌群研究较为缺乏，研究代表性不足。

通常，要实现对胃和小肠菌群的取样，侵入性取样方法是必不可少的，如食管胃镜检查、结肠镜、管腔刷检，甚至是采取肠切除手术。此外，也可以考虑采用其他方法，如直接以进行了回肠造口术的患者作为研究对象，开展小肠菌群分析，然而此类受试患者有限，样品也很容易受到皮肤菌群等污染。

随着科技的进步，目前已经研究出了一些新的非侵入方法，比如拥有 pH 和温度传感器以及独立电池的胶囊内镜。这些胶囊内镜可以定点采集菌群样本，并且随着技术的发展，成本也在逐步降低。然而，依旧存在一些这些仪器所无法解决的问题，如污染（来自指定采集点之外的区域所造成的污染）、样品保存等问题。

取样是菌群研究的关键步骤，因此在取样时除了要谨慎择取采样方法，还应制定严格的纳入和排除标准，以避免采样结果出现偏差，例如，感染、近期使用的抗生素或其他药物、饮食结构变化、并发症等因素都可能会引起菌群失调。

从扩增子测序到鸟枪法

扩增子测序法虽然比较传统，但仍是当前微生物组领域最常用的技术，如针对细菌的 16S rRNA 测序法和针对真菌的 ITS 测序法。此类方法存在一定局限性，主要有聚合酶链式反应（PCR）会引入偏差，以及基因测序区域有限、分类不够精确等问题。

大多数用于表征细菌的分子工具，其原理都是基于细菌基因组之间所存在的进化关系。由于 16S rRNA 基因序列高度保守，并且易于识别进化关系，因此基于 16S rRNA 基因的比对结果，对细菌进行分类是当前最为流行的技术。通过这种方法，细菌可以被归类到某个特定的属，甚至有时候可以通过将获得的序列与 GeneBank 和 rDNA 数据库中已经表征的物种序列进行对比，从而把细菌归类到某个特定的种。

然而还是存在很多分类困难的情况，比如当遇到新的细菌时，或者有时由于某些细菌基因序列的同质性较高，难以对细菌进行分类。

采用扩增子测序法可以确定肠道菌群的生态学特征，如特定细菌或真菌的多样性和丰度。这表明，该方法可以用于表征存在的主要微生物，并对个体或群体间进行比较。最常见的生态学参数是 α 多样性、β 多样性、相对丰度。

随着技术的发展，现在越来越多的菌群研究开始采用鸟枪法，对微生物的全基因组进行测序。该方法可避免因 PCR 扩增导致的潜在偏差，因为这一方法主要通过对样本中所有 DNA（或 RNA）进行测序，无需事先进行基因标记物的扩增。由于这种方法可以实现对真菌和细菌进行同时测序，而非单独测序，也使得同一样本中的微生物谱图得以拓宽。

除此之外，鸟枪法宏基因组学还可以对菌群中的“暗物质”（宿主病毒、噬菌体和从未表征过的 DNA 片段）进行分析，这也为肠道菌群的生态学特征提供了更为准确的分析。

而随着长读长测序技术的普及，较长片段的拼接比对提供了更精确的分类结果。因此，操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）或扩增子序列变异体（amplicon sequence variants，ASV）的使用率将迅速降低。

此外，鸟枪法宏基因组学还可以帮助我们找出细菌和真菌的代谢与功能基因，以对生态学特征表征进一步补充。

出于对菌群中罕见微生物的识别必要性，鸟枪法所面临的问题主要是测序深度。就此而言，首先要注意的点是，与扩增子测序法相比，鸟枪法在较低的测序深度所能提供的关于肠道菌群中罕见微生物的信息更少。而且，鸟枪法还存在一个问题，那就是由于采样方法受限，有些样本所得到的序列大部分来源于人体，而非菌群，这一点在活检标本及管腔刷检标本中尤为明显。

尽管与环境样本相比，肠道菌群是目前研究最多的部位，但相关数据库仍然不完整，信息还是有所缺失。因此，虽然很多信息可以通过测序等方式得到，但却无法得到有效利用。

功能宏基因组学

除了新测序技术的获取，生物信息学工具也可以帮助我们对肠道菌群功能建立起更全面的认知。Picrust2 等工具可以实现基于扩增子测序得到的数据，推断出微生物群落中的代谢与致病基因。尽管这类工具无法直接得到功能特征信息，但也有助于我们理解可能发生在菌群失调过程中的代谢变化。

鸟枪法可以直接得到微生物群落的功能特征信息，如代谢与毒力基因。如果把微生物群落视作一个整体，那么了解微生物群落的功能特征则比组成更重要。此外，为了对测序结果作进一步补充，通常可以通过生物信息学分析，表征特定功能，如抗生素抗性基因或移动遗传元件。

耐药动力学是“ one health 假说”倡导的重要特征，也是抗生素抗性基因在人类、动物和环境之间转移的证据。对于移动遗传元件，为了确定其质粒/转座子/整合子的结构，需要结合长读长测序技术和短读长测序技术。噬菌体虽然是细菌水平基因转移的重要参与者，然而有关噬菌体在抗生素抗性基因转移中所发挥的作用，是否如同在毒力基因传播中表现得那样，至今尚未揭晓。

多组学联合分析

多组学或整合组学（基因组学-转录组学-蛋白组学-代谢组学）正成为生物信息学领域重要且便于使用的工具，可以全面表征与疾病有关的菌群功能，以及随时间推移个体内的变化情况，这些变化有别于因疾病、抗生素、饮食变化等引起的任何失调。

由于每个组学都有自己的实验流程，而且有时需要从同一个体中提取多个样本，因此每个组学都是独立进行的，不过所有结果都会进行联合分析，以重构菌群生理网络。此外，运用多组学方法不仅能了解微生物群落，还可以了解其与宿主的关系，这也是件很有意思的事情。

这种方法所面临的挑战主要是如何将由大量实验产生的不同类型的数据整合到一起。边际相关分析、回归分析、高斯或贝叶斯模型等统计方法主要用于解决那些由多个统计学独立观测所推断得出的基因、转录、蛋白质和代谢物之间关系。正如所有新领域在探索过程中都会历经的那样，这些统计方法在质疑声中不断改进前行，直到摸索建立出一套适合研究肠道菌群生理学的方法。

原文链接：

WGO handbook on gut microbiome：a global perspective

作者｜Paúl Cárdenas, MD, PhD

编译｜77

审校｜617

编辑｜三木

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