外泌体环状RNA——癌症诊断标志物

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今天，在生命科学领域，复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所的何祥火教授通过对外泌体（exosome）的环状RNA（CircularRNA，circRNA）测序，将外泌体，circRNA与肿瘤成功的联系到了一起，开创性的提出了外泌体的circRNA可以作为肿瘤诊断的生物标志物（Biomarker）的结论，为肿瘤诊断提供了新的发展方向。

CircRNA是一类最近才在哺乳动物中被认为具有生物学功能的不具备编码蛋白质能力的非编码RNA[1-4]。相比于线性化的RNA而言，此类RNA的研究较少，生物学功能大多不为人所知。根据已有的研究表明，circRNA较多的作为miRNA的海绵体（sponge）而存在[5]。相比于线性化RNA而言，circRNA表现出了非同一般的稳定性[4, 6]。外泌体是一类在大多数细胞中都存在的具有内吞作用的小的囊泡，包含一些转运蛋白，mRNA与miRNA。有研究表明，这些在外泌体中的生物大分子可以作为生物标志物用来对人类疾病进行诊断[7]。
在何祥火教授最新发表的论文中，研究人员第一次发现了外泌体中同样存在大量的circRNA。RNA-seq数据表明外泌体中的circRNA的富集程度要高过普通细胞circRNA的富集水平。不仅如此，外泌体中circRNA的种类还会随着细胞中miRNA的变化而变化。此外，超过1000个circRNA在血清外泌体中被检出。来源于人源性肿瘤异种移植（human cancer xenograft）的circRNA可以在血清中得以检测。有趣的是，血清外泌体circRNA可以用来在正常人群中区分结肠癌（colon cancer）患者。研究人员的结论论证了circRNA在外泌体中的存在并且暗示了外泌体中的circRNA同样可能是具有生物学功能的。

实验结果

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外泌体的分离与circRNA测序

研究人员首先分离得到了来自于MHCC-LM3肝癌细胞的外泌体并且对其进行了circRNA的RNA-Seq。数据分析结果表明，在细胞和外泌体中分别检测到了5484个和6751个circRNA。研究人员将这些在外泌体中存在的circRNA命名为exo-cir-cRNA。与细胞中的circRNA的表达水平相比，Exo-circRNAs在外泌体中的含量至少富集了2倍（average of SRPBM: exo-circRNA, 1.32; cellular circRNA, 0.57）（Fig 1A）。研究人员进一步的定量PCR分析确认了circRNA在外泌体中的富集。而exo-circRNA的表达水平与细胞circRNA有着部分的联系（Fig 1B; Person correlation coefficient r=0.43）。这表明了特异的外泌体circRNA可能会受到正向调控。不仅如此，研究人员依然纯化得到细胞内含有ployA尾的RNA并且进行了RNA-seq。研究人员发现，circRNA在外泌体中大量富集，在细胞中也有存在，然而在对polyA尾的RNA测序中，基本没有监测到circRNA（Fig 1C）。对于每个circRNA。研究人员据此预测了circRNA和与之对应的线性化RNA的相对比例。结果表明，circRNA在细胞中的表达量和与之对应的线性化RNA的比例大约为6:1（Fig 1D）。

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外泌体circRNA的生物学功能

circRNA同miRNA的结合早有报道，巧合的是miRNA在外泌体中也广泛存在。这促使研究人员关注于miRNA与circRNA的结合对circRNA在外泌体中数量的影响。由于CDR1as circRNA是miR－7的海绵体[3, 4]，研究人员将miR-7引入细胞与外泌体中，借此观察CDR1as的表达量。有趣的是，研究人员观察到CDR1as表达量在外泌体中大幅下降，却在细胞中略有上升（Fig 1E）。该结果表明，circRNA在外泌体中的确会受到miRNA表达量的影响和调控（Fig 1F）。

考虑到circRNA在外泌体中富集，研究人员进一步猜测exo-circRNAs可以在人类血液中被检测到。RNA-seq数据表明，1215个circRNA在血液中存在，超过90%的circRNA为编码蛋白的外显子组成（Fig 1G）。绝大多数血清exo-circRNAs长度<1000nt，平均长度为350nt（Fig 1H）。进一步研究发现，exo-circRNAs在血清中极为稳定，室温下24小时依然还有活性（Fig 1J）。

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Exo-circRNAs在肿瘤治疗中的意义

为了确定肿瘤exo-circRNAs同样参与了exo-circRNAs的循环，研究人员构建了人类MHCC-LM3肿瘤细胞的小鼠异种移植体模型。人类CDYL circRNA在血清中被稳定检测到（Fig 1K）。同样血清中肿瘤exo-circRNAs的富集程度与肿瘤的大小有关（Fig 1L）。研究人员为了研究肿瘤exo-circRNAs作为生物标志物的可能性，还对肿瘤病人与健康供体的血清exo-circRNAs表达模式进行了比较。与正常血清（normal serum, NS）circRNAs类似，来自11个结直肠癌患者的样本同样被拿来进行RNA测序。数据分析结果发现，癌症样本中circRNA表达模型与正常组织表达模型存在于大差异。与正常组织相比，肿瘤组织中67个circRNA缺失，同时新产生了257个仔正常组织中不存在的circRNA（Fig 1M）。肿瘤组织中，大约90%的circRNAs的同源基因表达量显著升高。

结论

circRNA作为一种新发现的具有生物学功能的环状RNA，使得人们对于“中心法则”有了更深一层的了解。可以说，circRNA的每一个新发现对于人们来说都是一个惊喜。本文中，研究人员首先通过RNA测序实验发现了外泌体中的circRNA，进而发现外泌体中的circRNA同样具有潜在的生物学功能。并且成功地将外泌体中的circRNA和肿瘤诊断联系到了一起。研究人员通过对exo-circRNAs的研究进一步拓展了人们对于circRNA的认知，将circRNA，外泌体与肿瘤诊断紧密的联系到了一起。相信将来exo-circRNAs在肿瘤诊断中一定会展现出重要的价值。

参考文献

1.Jeck, W.R., et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. Rna, 2012. 19(2): p. 141-157.

2.Julia, S., et al., Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. Plos One, 2012. 7(2): p. e30733.

3.Hansen, T.B., et al., Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature, 2013. 495(7441): p. 384-388.

4.Sebastian, M., et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Journal of Oral & Maxillofacial Surgery Official Journal of the American Association of Oral & Maxillofacial Surgeons, 2013. 71(8): p. 1439–1449.

5.Xin, Z., et al., The understanding of circular RNAs as special triggers in carcinogenesis. Briefings in Functional Genomics, 2016.

6.Julia, S., et al., Cell-type specific features of circular RNA expression. Plos Genetics, 2013. 9(9): p. 119-129.

7.Pant, S., H. Hilton, and M.E. Burczynski, The multifaceted exosome: Biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities. Biochemical Pharmacology, 2012. 83(11): p. 1484-1494.

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