浙大申有青教授课题组Adv. Mater.：“一石二鸟”——肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞双转染非病毒载体用于癌症基因治疗

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白细胞介素12(IL-12)是一种强大的促炎趋化因子，能够增强细胞毒性T细胞介导的癌细胞杀伤效果。基于IL-12的癌症基因治疗可以克服IL-12生长因子产生的致命副作用，但由于缺乏能够有效转染肿瘤以产生足够的IL-12的系统基因载体，其临床转化应用也受到一定限制。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤中重要的细胞组分，占有很高的比例，在某些肿瘤中甚至可达到50%。尤其重要的是，TAM是IL-12的重要生产细胞之一。因此我们设想若能实现IL-12在TAM中的高效转染，将有望实现IL-12在肿瘤组织内的成功递送，从而重塑肿瘤免疫微环境。但TAMs有很强的吞噬能力，会将很大一部分经历了“层层屏障”才到达肿瘤内的纳米药物吞噬掉，并通过其强大的消化和酶解作用使得纳米药物失效。对于易降解的基因药物来说，如何实现在TAM内的高效基因输送一直是研究的瓶颈难题。

近日，浙江大学申有青教授课题组联合国家纳米科学中心陈春英研究员在《Advanced Materials》发表题为“Tumor-Associated Macrophage and Tumor-Cell Dually Transfecting Polyplexes for Efficient Interleukin-12 Cancer Gene Therapy”的研究论文，浙江大学申有青教授，国家纳米中心陈春英研究员和刘颖研究员为共同通讯作者，浙江大学博士后邱娜莎（现为国家纳米科学中心特别研究助理）为论文第一作者。在前期工作中，他们设计合成了系列酯酶响应的非病毒基因输送载体，并利用在肿瘤微环境中不同类型细胞内酯酶含量的差异来实现基因在肿瘤细胞的选择性释放和表达。（Adv. Mater. 2016, 28, 10613–10622. Biomacromolecules 2018, 19, 6, 2308–2319）。本文中，利用TAMs胞浆中酯酶也高表达的特点，他们设计了一种可同时高效转染肿瘤细胞和TAMs的基因输送系统。该输送系统能够同时实现在肿瘤细胞和TAMs中快速溶酶体逃逸并在细胞浆中酯酶的水解下快速释放DNA，使DNA能够快速入核进行目的基因的转录和表达。从而使得肿瘤细胞和TAMs都成为白介素-12的生产“工厂”，进而有效激活抗肿瘤免疫反应并重塑肿瘤微环境。

Scheme 1 能同时转染肿瘤细胞和TAMs的IL-12基因输送系统。

酯酶响应型阳离子聚合物有效压缩IL-12质粒，形成纳米复合物，经脂质体包载之后得到最后的基因输送系统APEG-LP/pIL12。经系统给药后，该基因输送体系在肿瘤靶向肽（AEAA）的靶向作用下，主动靶向肿瘤组织，并在肿瘤细胞和TAMs中实现了IL-2的高效转染，使两者都成为IL-12的加工厂，从而重塑肿瘤免疫微环境，使得M2型巨噬细胞向M1型转变，肿瘤杀伤T细胞和NK细胞含量显著上升，而免疫抑制Tregs细胞含量显著降低。从而获得高的体内抗肿瘤活性。

图1 酯酶响应的阳离子聚合物PQDEA在巨噬细胞Raw264.7和肿瘤细胞KPC中都表现出高效的基因转染能力。（A）荧光素酶基因转染;（B）绿色荧光蛋白基因转染。

图2 PQDEA/Cy5pLUC在巨噬细胞和肿瘤细胞中的内吞和细胞亚分布情况。

(A)与PEI相比，PQDEA能显著提高纳米复合物在巨噬细胞和肿瘤细胞中的内吞速率。（B）内吞抑制实验表明，纳米复合物主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入巨噬细胞和肿瘤细胞；（C）内吞抑制剂对巨噬细胞和肿瘤细胞的基因转染情况；（D）PQDEA/Cy5pLUC纳米复合物在肿瘤细胞和巨噬细胞中的溶酶体逃逸情况。

图3 APEG-LP/pIL12在多种模型中表现出优异的抗肿瘤效果，并显著延长实验动物的存活期。

图4 APEG-LP/pIL12治疗后对肿瘤免疫微环境的重塑作用。

A）肿瘤微环境中的免疫相关细胞的数量变化。可见肿瘤杀伤免疫细胞（CD8+ T ，IFNγ+）数量显著上升，而免疫抑制细胞（MDSC, Tregs）含量显著降低。B)肿瘤微环境中免疫相关生长因子的表达情况。可见促进肿瘤免疫反应的相关因子如IL-12，IFNγ，CD8，TNF-α等含量显著上升，而免疫抑制因子CCL2和TGF-β等含量显著降低。C）抑瘤结束后，肿瘤组织中抑制肿瘤生长的蛋白标记物（IL-12，CD8）和促进肿瘤生长的相关蛋白（F4/80, CD206, α-SMA, CD31等）的表达情况。

本论文首次设计了IL-12的非病毒基因输送载体，实现了肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞中IL-12的高效转染，从而使两者都成为IL-12的加工厂。而高表达的IL-12能重塑肿瘤免疫微环境，使M2型巨噬细胞向M1型转变，显著提高肿瘤杀伤免疫细胞（CD8+T，IFNγ+）数量，并使得免疫抑制细胞（MDSC, Tregs）含量显著降低。最终在多种肿瘤模型中验证了该IL-12输送系统具有高效抗肿瘤活性，并能显著提高实验动物存活期。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202006189

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