四川大学廖金凤研究员课题组《MAT SCI ENG C-MATER》：温和光热水凝胶用于颅骨再生

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由于创伤、先天性异常、关节炎和衰老等因素，骨缺损的发生率一直在增加，对临床医生来说是一个巨大的挑战。目前，自体移植和异体移植被用于临床治疗。然而，诸如供体有限、免疫排斥和高成本等缺点限制了应用。因此，迫切需要开发新的使用方便，效果优异，对身体的伤害小的骨缺损修复策略。光热疗法（PTT）作为解决这一问题的一种方式，已经得到了研究人员和临床医生的关注。近红外光（NIR）容易控制，对正常组织影响较小。近年来，温和热疗（40°C-43°C）在伤口愈合和骨再生方面显示出巨大的潜力。温和PTT可以促进间质干细胞（MSC）的分化和成骨细胞的成熟，主要原因有上调热休克蛋白，增强血液流动，促进营养交换等。虽然机制尚不清楚，但有学者提出了一些假设，包括线粒体的基因表达光子吸收和影响新生成血管的血液循环等。聚多巴胺（PDA）纳米颗粒在红外波长下表现出良好的光热效应，作为温和光热疗法应用于骨缺损的一个可行选择。他们制备了甲基丙烯酰化明胶/聚（甲基丙烯酸甲酯）/聚多巴胺纳米粒（GelMA/PMMA/PDA）复合水凝胶，并对其进行了评估。
明胶氨基酸残基上的氨基与甲基丙烯酸（MA）中的键缩合，有助于形成更密集的网状结构，改善水凝胶的机械性能。GelMA水凝胶具有良好的细胞粘附和降解性能，并具有良好的机械性能和生物相容性。此外，通过控制MA的使用量和反应条件，可以调节水凝胶的性能。他们也尝试引入甲基丙烯酸甲酯（MMA）来改善水凝胶的机械性能。PMMA是一种广泛应用的骨水泥的主要成分。PMMA虽然没有良好的降解性，但可以添加用于稳定水凝胶的结构和改善其机械性能。也有研究发现，在水凝胶中添加PMMA对其生物相容性的影响很小。GelMA/PMMA/PDA水凝胶具有良好的光热性能、生物相容性和成骨作用。在大鼠颅骨缺损模型中，与水凝胶组和空白对照组相比，温和光热治疗的GelMA/PMMA/PDA水凝胶具有更好的骨修复效果。因此，这种具有温和光热的水凝胶具有优良的促成骨能力，为治疗骨缺损提供了一种新方法。

图1. (A) GelMA/PMMA/PDA水凝胶的制备。(B) GelMA/PMMA/PDA水凝胶与温和PTT用于颅骨再生的示意图。

图2. (A) PDA纳米颗粒的SEM图像。(B) PDA纳米颗粒的颗粒大小和尺寸分布。
 
图3. (A) GelMA/PMMA/PDA混合水凝胶的截面的SEM图像。(B)水凝胶连续五个加载-卸载周期的压缩。(C) GelMA/PMMA/PDA混合水凝胶的溶胀率。(D）GelMA/PMMA/PDA水凝胶在功率密度为0.99W/cm2的近红外照射下的实时热图像和（E）升温-冷却循环曲线。图3呈现了冻干水凝胶的横截面、力学性能、溶胀性能、光热效应。

图4. (A) 通过CCK-8试验对水凝胶浸出液进行细胞存活率测试；n = 6 (B) 在对照组、水凝胶组和水凝胶+PTT组培养7天的BMSCs的ALP染色。(C) 第7天的ALP活性的定量数据。(D) 不同组别的BMSCs在第14天的ARS；钙质结节被染成红色。(E) ARS的定量测量。数据是平均值和标准误差；n = 3。*P < 0.05, **P < 0.01.

在细胞实验中，培养1、3、5、7天后，细胞活力随水凝胶浸出物浓度的增加而增加（图4A）ALP染色和比色法说明，与对照组和纯水凝胶组相比，水凝胶+PTT组的ALP活性增加（图4B和4C）。水凝胶+PTT组的矿化结节密度高于对照组和纯水凝胶组（图4D）。因此，GelMA/PMMA/PDA复合水凝胶加PTT促进了BMSCs的成骨分化。 
图5. (A) 植入后1、2、4和8周时剩余的GelMA/PMMA/PDA混合水凝胶和周围小鼠背皮的照片和(B)H&E染色图像。"H "表示水凝胶）。将水凝胶植入BALB/c小鼠背部皮下，在1、2、4和8周时对植入部位周围的组织进行H&E染色。观察到水凝胶的逐渐降解（图5A）。H&E染色如图5B所示，没有观察到明显的炎症反应，表明水凝胶具有良好的生物相容性，适合在体内应用。图6. (A) 大鼠颅骨缺损的体内修复示意图。(B) 水凝胶+PTT组大鼠在808nm激光照射下的红外热图。(C) 在治疗过程中，每隔5天对大鼠颅骨缺损区域进行光热处理，其温度变化的光热曲线。他们进一步进行了修复大鼠颅骨缺损的实验。图6A是动物实验的设计示意图。如图6B、C是在光热处理期间的温度变化。水凝胶的这种温和热刺激对骨缺损有重要作用。图7. (A) 对照组、水凝胶组和水凝胶+PTT组4和8周后头骨的MicroCT重建。(B) 4和8周后大鼠头骨样本的横截面重建。(C）各组颅骨的骨量密度（BV/TV）参数（*P < 0.05；**P < 0.01）。在显微CT观察中（图7A，B，C），与对照组和纯水凝胶组相比，水凝胶+PTT组对再生骨的处理有明显改善。图7B展示了冠状切面上的骨组织修复程度，可以清楚地看到，缺损修复主要是从边缘向中心进行的。综上所述，这些结果表明水凝胶+PTT联合治疗促进了颅骨的再生。

图8. (A) 不同组别中，颅骨缺损部位的H&E染色图像（HB，原骨；RB，修复骨；H，水凝胶）。(B) 不同组别中颅骨样本的Masson染色图像。(HB，原骨；RB，修复骨；F，胶原纤维）。

此外，他们用H&E和Masson染色评估了缺损区域的修复。如图8A所示，与其他两组相比，水凝胶+PTT组在第4周和第8周都有相更可观的骨缺损修复。相比之下，对照组和水凝胶组的骨缺损修复都很有限，主要的变化是在缺损区出现了明显的结缔组织。Masson三色染色（图8B）显示，与对照组和纯水凝胶组相比，水凝胶+PTT组有更多胶原纤维形成。因此，具有温和光热效应的GelMA/PMMA/PDA水凝胶可以有效地治愈骨缺损。

通讯作者：廖金凤；第一作者：吴妍廷；第二作者：张旭；第三作者：谭博文；第四作者：单越；第五作者：赵鑫

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.msec.2022.112641

通讯作者简介：

廖金凤研究员，主要从事新型生物材料的构建及其在骨组织工程及骨肿瘤治疗方面的应用基础研究，已在Bone Res., Bioactive Mater., ACS Appl. Mater. Interfaces, J. Nanobiotech., Theranostics, Nanoscale, Mater. Sci. Eng. C等国际知名SCI期刊以通讯作者或第一作者身份发表论文40余篇，H-index为25，其中有2篇论文入选ESI “高被引论文”，2篇入选为ESI“热点论文”。荣获2016年度“香江学者”奖，主持国家自然科学基金面上项目2项，青年科学基金1项，四川省科技厅项目1项，成都市科技局国际合作项目1项及四川大学创新火花项目1项等，受理专利2项，参编英文论著2本，为多个期刊的审稿人，被中国化学快报评为优秀审稿人。担任中华口腔医学会第七届口腔材料专业委员会青年委员，四川省口腔医学会口腔生物学专业委员会委员等。

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