Plant Cell | MYC2级联调控茉莉酸介导的番茄免疫机制
茉莉酸激素（JA）在植物免疫中发挥重要功能，主要通过在植物中触发全基因组转录重编排来调控对病原菌和昆虫攻击的抗性。但目前对茉莉酸激活植物免疫转录重编程的机理所知甚少。中科院李传友老师、山东农业大学赵久海老师携手百迈客对于MYC2级联调控茉莉酸介导的番茄免疫机制进行了研究，文章发表在国际知名期刊《Plant Cell》上。
标题：MYC2 Orchestrates a Hierarchical Transcriptional Cascade That Regulates Jasmonate-Mediated Plant Immunity in Tomato
期刊：Plant Cell
IF：8.7
背景
茉莉酸是来源于不饱和脂肪酸的植物免疫激素，其生物合成途径和化学结构与高等动物中的免疫激素前列腺素有极高的类似性。在受到机械伤害、咀嚼式昆虫和死体营养型病原菌的侵害时，植物激活茉莉酸信号通路，启动并级联放大茉莉酸介导的转录重编程，从而产生有效的防御反应。但目前对茉莉酸激活植物免疫转录重编程的机理所知甚少。
材料方法
实验材料：番茄幼苗
研究手段：
1）RNA-Seq （百迈客Illumina HiSeq 2500平台）
分别对野生型和突变体材料的处理组和对照组做RNA测序，三个生物学重复
2）Chip-seq 茉莉酸甲酯处理的转基因植株，两个重复
验证方法：
酵母双杂实验、EMSA实验、Pull-Down实验
结果
1
灰霉病菌依赖COI1的方式激活虫害损伤响应和病原菌响应基因
在番茄中，TD作为虫害应答的标志基因，PR-STH2作为病原菌应答的标志基因。当野生型番茄植株被灰霉病菌侵染24h后，TD和PR-STH2的表达量显著升高，这与病害开始扩展的时间是相符的。这些结果表明，在番茄中防御灰霉病菌入侵，响应了虫害应答和病原菌应答两种机制。
为了评估在番茄中抵御灰霉病菌入侵中，依赖COI1的JA信号转导发挥的作用，首先比较了受灰霉病感染后，野生型番茄和茉莉酸迟钝的转基因番茄（jai1）叶片上的坏死斑大小。结果突变体植株叶片的坏死斑面积是野生型的3倍，说明突变体受病菌侵染的更严重。与这一发现相一致，在jai1植株中，TD和PR-STH2的表达量也相较于野生型偏低。综上，依赖COI1的SA信号转导在番茄响应灰霉病菌入侵时发挥重要的作用。
2
在植物响应灰霉病菌入侵时，MYC2发挥着重要的作用
作者试图鉴定在番茄中JA诱导的防御系统中，COI1下游的TF表达情况。其中MYC2是一个较好的候选者。为了验证MYC2在灰霉病诱导的植物防御中的地位，作者构建了MYC2-RNAi植株。经灰霉病菌侵染后的植株，MYC2-RNAi植株的病斑面积明显大于野生型植株。
3
RNA-seq结果
在JA信号转导过程中，为了鉴定基因被MYC2调控，我们对MYC2-RNAi-3和野生型幼苗分别用或不用MeJA处理，三个生物学重复，进行了RNA-seq实验。RNA-seq的数据分别用ANOVA和成对比较两种分析方法进行分析。ANOVA的分析结果显示，有4774个基因的表达受到处理的影响，1612个基因的表达受到基因型的影响，1199个基因的表达受到处理和基因型的相互作用。这些结果与拟南芥的结果相一致的。受到相互作用影响的1199个基因叫做MYC2诱导的JA响应基因。1199个基因中，受到JA调控的有1120个，受MYC2调控的有1005个。
受到JA和MYC2共同调控的2558个基因，JA作用下，其中有1078个是上调的，1480个是下调的。感兴趣的是，受JA上调的1078个基因中的95%在MYC2下也是上调的。同样地，受JA下调的1480个基因中的98%在MYC2下也是下调的。
在RNA-seq试验中，鉴定出了受JA诱导的基因，包括几个JA合成基因，如：AOC、AOS、OPR3、TomLoxD，几个JAZ基因，还有几个之前鉴定出的防御基因，如TD、LAPA、PR-STH2等。
4
全基因组层面鉴定MYC2的结合位点及motif（Chip-seq）
接下来使用chip-seq的结果来鉴定MYC2的结合峰。在启动子区上游3kb以内包含1个或多个结合位点定义为MYC2靶标基因。分别从两个生物学重复中，鉴定出18784个个12234个MYC2结合峰。有7594个结合峰是两个重复所共有的，使用这些结合峰，鉴定出了3389个MYC2的靶标基因。
全基因组分布分析显示，MYC2结合位点高度富集在转录起始位点（TSS）上游3kb的启动子区，占MYC2靶标基因的47%。为了研究MYC2在启动子区的详细的MYC2结合谱，通过计算了每两个峰顶之间的距离，结果以直方图展示。直方图结果展示，MYC2结合位点高度富集在启动子区，在TSS上游的200bp处。
为了鉴定MYC2的结合motif，提取峰顶的500bp侧翼序列，进行MEME-chip实验，计算及统计重合的motif。结果鉴定出了两个motif，分别是CACRYG和GGNCCM。CACRYG富集在峰顶，而GGNCCM富集在峰顶+-50bp处，这说明MYC2可能通过一个辅因子靶标到GGNCCM这个motif。EMSA实验同时显示，MYC2与包含CACRYG的DNA探针紧密结合，但是与包含GGNCCM的DNA探针不能直接结合。这些结果表明，MYC2在体内外均能与CACRYG直接结合。
5
MYC2靶标的JA响应基因富集在早期JA响应基因
Chip-seq和转录组结果的联合分析，我们共鉴定出了655个受到MYC2和JA共同调控的基因，叫做MTJA基因。在这些MTJA基因中，有470个是通过MYC2上调的，185个是通过MYC2下调的，这证实了在JA响应的调控基因表达中，MYC2的主要功能是作为转录激活因子。
为了评估受到MYC2和JA共同调控的2558个基因的表达时间，我们利用野生型植株，机械损伤处理，分别取0，1，6，12个小时的材料做转录组测序。我们定义基因的fold change 值在1个小时达到最大时，称为早期基因，基因的fold change 值在12个小时达到最大时，称为晚期基因。结果发现，受到MYC2和JA共同调控的2558个基因中的395个属于早期基因，763个属于晚期基因。MTJA基因中的早期基因频数显著高于受到MYC2和JA共同调控基因，而晚期基因的结果是相反的。这说明早期JA应答基因富集在MTJA基因中，但是后期JA应答基因没有富集在MTJA基因中。早期JA响应基因，包括4中JA合成基因（AOC、AOS、OPR3、TomLoxD），5个JAZ基因（JAZ1，JAZ2，JAZ5，JAZ6，JAZ9）被鉴定为MTJA基因。表明MYC2直接调控早期JA响应基因。
MTJA基因的GO分析结果
6
抵御灰霉病菌感染时，MYC2靶标的TF发挥着重要的作用
655个MTJA基因中，50个是MTF基因，占MTJA基因的7.63%。MTJA基因中的MTF基因的频数显著高于在整个番茄基因组中的TF数。
为了调查MTF在调控JA应答基因表达的作用方式，作者选择了29个MTF基因，并考察它们在抵御灰霉病菌入侵时的表达。结果，这29个MTF基因被明显分为3类。这些结果表明，这些MTF可能作用在MYC2的下游，差异调控机械损伤和病原菌应答。
A：MTJA基因的表达热图；B：JA2L被机械损伤强烈诱导；
C：ERF.C3被病原菌侵染强烈诱导。
7
JA2L是一种机械损伤应答MTF，在抵御灰霉病菌感染中发挥重要的作用
Chip-seq实验和启动子区测序分析，显示MYC2与JA2L的TSS上游2700bp的CACATG这一motif相结合。受MeJA处理后，MYC2与该motif结合富集在1小时明显地增加，在12和24小时明显地降低。平行实验表明，机械损伤应答基因TD在promoter区也存在CACATG，但是经MeJA处理或不处理，几乎没有MYC2与该motif相结合。
作者比较了野生型和MYC2-RNAi植株受灰霉病菌诱导时，JA2L的表达量。正如qPCR的结果显示，受灰霉病诱导的JA2L的表达在MYC2-RNAi植株中显著降低。同时比较了野生型和JA2L-AS植株中JA2L的表达，在感染灰霉病菌3天后JA2L-AS植株的坏死斑显著大于野生型。这些结果说明，在灰霉病诱导的JA调控响应中，JA2L是一个真正的MTF，且作用于MYC2的下游。
8
JA2L调控TD的表达
由于JA2L优先被机械损伤诱导，作者推测MYC2-JA2L模型主要调控机械损伤应答基因。之后调查了MYC2，JA2L和TD基因的损伤诱导的表达模式，发现由机械损伤诱导的这些基因表达是以顺式方式进行。MYC2的表达水平达到最大时是在损伤0.5h以后，然后开始降低；JA2L的表达峰值在损伤1h之后，随后开始降低；但是TD的表达在损伤12h时达到峰值。而MYC2，JA2L和TD的表达量增加分别是10×，100×，1000×，表明这三个基因在损伤应答机制中，是是一种级联放大的效应。
NAC家族的转录因子优先与已知的NAC核心结合点的CACG motif结合，测序分析发现，在TD的TSS上游135bp处鉴定出了CACG motif。Chip-qPCR实验分析JA2L-GFP植株和anti-GFP抑制株说明JA2L与这个motif富集。MBP-JA2L融合基因和包含CACG的一个38bp的DNA探针的EMSA实验证明，MBP-JA2L与DNA探针相结合，说明MBP-JA2L与TD的结合是依赖CACG motif的。
综合这些结果，在JA诱导的植株防御应答中，MYC2直接调控MTF JA2L，再依次直接调控后期损伤应答基因TD的表达。
9
ERF.C3是一种机械损伤应答MTF，在抵御灰霉病菌感染中发挥重要的作用
Chip-seq实验和启动子区测序分析，显示MYC2与ERF.C3的TSS上游1500bp的CACATG这一motif相结合。受MeJA处理后，MYC2与该motif结合富集在1小时明显地增加，在12和24小时明显地降低。平行实验表明，病原菌应答基因PR-STH2在promoter区也存在CACATG，但是经MeJA处理或不处理，几乎没有MYC2与该motif相结合。
比较野生型和MYC2-RNAi植株受灰霉病菌诱导时，ERF.C3的表达量。正如qPCR的结果显示，受灰霉病诱导的ERF.C3的表达在MYC2-RNAi植株中显著降低。我们还比较了野生型和ERF.C3-SRDX植株中ERF.C3的表达，在感染灰霉病菌3天后ERF.C3-SRDX植株的坏死斑显著大于野生型。这些结果说明，在灰霉病诱导的JA调控响应中，ERF.C3是一个真正的MTF，且作用于MYC2的下游。
10
ERF.C3调控PR-STH2的表达
由于ERF.C3优先被病原菌诱导，我们推测MYC2- ERF.C3模型主要调控病原菌应答基因。有证据支持这一假设：一、受病原菌感染后，MYC2，ERF.C3和病原菌应答标志基因PR-STH2的表达量增加；二、chip-qPCR实验结果显示，MYC2与ERF.C3的启动区CACATG motif结合富集受灰霉病菌诱导。为了证明ERF.C3在抵御病原菌中发挥的作用，我们构建了一株ERF.C3表达量增高的ERF.C3-OE植株。根据病斑大小说明，与ERF.C3-SRDX植株降低对灰霉病的防御相反，ERF.C3-OE植株增加额对灰霉病的防御。灰霉病诱导的PR-STH2的表达水平在ERF.C3-OE植株中高于野生型植株，但是，ERF.C3-SRDX植株低于野生型植株。这说明ERF.C3在调控病原菌感染的PR-STH2的表达中起着正向的作用。
调查了ERF.C3是否与PR-STH2的promoter结合。测序分析发现，在PR-STH2的promoter区包含了一个GCCGCCC motif，能与ERF.C3优先进行结合。Chip-qPCR实验分析ERF.C3-GFP-1植株和anti-GFP抑制株，说明ERF.C3与这个motif富集。MBP-ERF.C3融合基因和包含GCCGCC的一个DNA探针的EMSA实验证明，MBP-ERF.C3与DNA探针相结合，说明MBP-ERF.C3与PR-STH2的结合是依赖GCCGCC motif的。
综合这些结果，在JA诱导的植株防御应答中，MYC2直接调控MTF ERF.C3，再依次直接调控后期病原菌应答基因ERF.C3的表达。
结论
本研究以番茄与灰霉病菌的互作，作为模型，揭示了MYC2作为主要的调控者级联调控JA诱导的植物免疫机制。说明了在拟南芥和番茄中，JA调控植物免疫应答机制的差异性。
文章亮点
1、本研究结合mRNA+chip-seq联合分析，内容丰富，多角度解析；
2、灰霉病菌侵染番茄后，分析了诱导了机械损伤应答和病原菌应答过程；
3、深入探究了番茄感染灰霉病菌后，MYC2级联放大调控茉莉酸介导的植物免疫过程；
4、采用多种实验手段进行交叉验证，结果验证更充分。
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营销中心-技术支持 李 云 | 文案
王德梅 | 审核
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