单细胞分析的最上游——处理Fastq文件：cellranger

写在前面

原先我们将这一部分内容安排在了整个课程的最后，是考虑到这部分内容需要一定的Linux基础。这并不代表这是一个下游的内容，相反，这是单细胞测序整个生物信息学分析中最上游的内容。作为承前启后的一个步骤，实验的部分到Fastq文件终止，生信的部分由Fastq文件开始（如果这里你不知道我在说什么，建议去看一下我们这个系列的第一讲：手把手教你做单细胞测序数据分析（一）——绪论）。如果是10X genomics平台做的测序，那么用cellranger处理Fastq文件即可，另一种主流的平台——dropseq，我们在下篇推送也会给大家介绍。 
形式上来说呢，原本应该安排一次视频课，但是考虑到这部分内容在Linux中完成，制作视频的成本过高。掌握Linux知识并拥有服务器的同学可能不需要视频教程，而没有Linux基础和服务器的同学看了视频也无法自己操作，因此本篇最终采用文字推送的形式呈现。没有条件自己操作的同学也可以在文末联系我。

往期回顾

保姆级教程，代码部分整理在往期推送之中：
手把手教你做单细胞测序数据分析（一）——绪论
手把手教你做单细胞测序数据分析（二）——各类输入文件读取
手把手教你做单细胞测序数据分析（三）——单样本分析
手把手教你做单细胞测序数据分析（四）——多样本整合手把手教你做单细胞测序数据分析（五）——细胞类型注释手把手教你做单细胞测序数据分析（六）——组间差异分析及可视化手把手教你做单细胞测序数据分析（七）——基因集富集分析
B站视频：https://www.bilibili.com/video/BV1S44y1b76Z/

其他单细胞相关技术贴也在这里：细胞的数量由誰决定？答读者问（三）单细胞测序前景答读者问（四）：如何分析细胞亚群答读者问（六）、Seurat中如何让细胞听你指挥
单细胞中应该如何做GSVA？

非技术帖：关于单细胞的事 谈谈后面的计划
Biomamba助推的第一篇论文发表啦

一、安装软件并查看帮助文档

wget -O cellranger-5.0.1.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-5.0.1.tar.gz?Expires=1608489066&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci01LjAuMS50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2MDg0ODkwNjZ9fX1dfQ__&Signature=bhGO1dQOi6xmaSl-XHACRN6wUjjdau-85VHyNHtPAU6eG~6v3urfrkX5E5uShfjwgCuxsuykcWnn2nJrnRN9UyAVyFnIlrhiswDL0T5Jkox4EBqQ~tL2WTivBGe5G8EFPIxFsPoKYv0FIdDoCQYGRlDaIWIIyu7Cg7dkPPfer5hUBPp6KfmXE3st47O4LV8ZW7ghkjnIPU57NuQa3ZRlIJ2FiEmFwKCfSzy0r3o6cFIfZ~HcaIqxP1Snk5~U9sCVqSKGryFBW9uaP89mbb855hen4J4JD58lxkxp8qwKbL6qH1y5g1VlgydLg5AFllnrkKUaDSCB1gohq4hHwP5Efw__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"
#下载安装包
tar -zxvf cellranger-5.0.1.tar.gz#解压
echo 'export PATH=/cellranger-5.0.1/:$PATH' >> ~/.bashrc
#把cellranger的路径加到$PATH中方便调用
source  ~/.bashrc
#更新系统配置文件
cellranger count --help
#查看cellranger使用说明

二、下载参考基因组

wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#人类参考基因组数据集
tar -xvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
wget https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#mouse参考基因组数据集下载
tar -xvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz

三、下载测试数据集走一遍流程

wget 'http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/2.1.0/neurons_900/neurons_900_fastqs.tar'
#测试数据集下载
tar -xvf neurons_900_fastqs.tar
cellranger count --id=result --transcriptome=../refdata-gex-mm10-2020-A/ --fastqs=/neurons_900_fastqs --sample=neurons_900 --expect-cells=1000 --nosecondary
 #成功运行命令！！！
 #这里解释一下cellranger的各个参数：
 cellranger count --id=sample \
                   --transcriptome=/opt/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0 \
                   --fastqs=/home/scRNA/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                   --sample=mysample \
                   --expect-cells=1000 \
                   --nosecondary
# id指定输出文件存放目录名
# transcriptome指定与CellRanger兼容的参考基因组
# fastqs指定mkfastq或者自定义的测序文件
# sample要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志
# expect-cells指定复现的细胞数量，这个要和实验设计结合起来
# nosecondary 只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析(反正后续要走Seurat，为了节省计算资源，建议加上)
#count函数参数解释 

四、硬件要求

不知道最小需要多少G才可以运行cellranger，但是单细胞测序的数据动辄就是100G（压缩前），所以理论上你的设备小于100GB是必然跑不动的。我这里的服务器是377GB的内存，总之如果大家有这样配置的设备，跑正常深度的Fastq文件应该是没有问题。

如何联系我们

最近发现后台中有一些消息我没能及时看到并答复，微信后台中超过48h后便不允许回复读者消息，这里还是再给大家留一下答疑的扣扣号，方便大家随时交流：1913507043。微信号可以点击喜欢作者后自动回复里有。大家可以阅读完这几篇之后添加我：如何搜索公众号过往发布内容
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