文献阅读（十九）、原发头颈癌和肿瘤转移微生态
Biomamba荐语
这是一篇2017年的《Cell》，测了18个样本才6000个细胞，还不到现在一个样本的细胞数量，算是单细胞测序很早期的作品了，但是经典永远是经典，这篇文章展现出的科研思路、生信分析技能上的成熟度值得所有业内人士参考，而不是像上一次分享那样，纯靠科研经费和胡乱的分析堆叠出的文章：
doi:
10.1016/j.cell.2017.10.044
链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867417312709?via%3Dihub
Highlight
● 对多种癌细胞、基质细胞和免疫细胞进行了单细胞RNA-seq测序。
● 揭示异质性：发现癌细胞的细胞周期、缺氧和上皮表达程序各不相同。
● 部分上皮间质转化程序 (p-EMT程序) 受肿瘤微环境调节。
● 计算建模改进了TCGA 亚型，将p-EMT程序与癌细胞转移联系起来。
Background
● 肿瘤内异质性研究：新颖、详尽、意义重大
● 以往肿瘤基因组学和转录组学研究都是针对大块肿瘤（比如整块的肝癌、喉癌组织），限制肿瘤内异质性的研究。实际上大量证据表明，恶性和非恶性细胞的肿瘤内异质性及肿瘤微环境 (TME) 内相互作用对肿瘤生物学至关重要。
● 单细胞表达谱助力上皮肿瘤研究
● 单细胞基因组学可以探索遗传和功能异质性。单细胞RNA测序在肿瘤、循环系统肿瘤细胞的研究和异种移植方面，提出了肿瘤成分、干细胞和耐药性的新见解。然而，上皮肿瘤转移到引流淋巴结（局部区域转移）和其他器官（远处转移）scRNA-seq 研究有一定优势，但没有深入表明其特征。肿瘤转移灶经常根据原发肿瘤的分子和病理特征进行治疗，这提出了提出了它们是否共享的遗传学、表观遗传学和治疗靶点的问题。然而，原发肿瘤和转移瘤的潜在不同组成阻碍了大块肿瘤特征比较。单细胞表达谱研究将提供令人信服的替代方案。
● EMT及细胞亚型在原发性肿瘤和转移瘤中的范围和意义不明
● 上皮-间质转化 (EMT) 被认为是上皮肿瘤扩散的驱动因素。EMT是胚胎发育的基础，可能被恶性上皮细胞选择以促进侵袭和传播，循环系统肿瘤中就能检测到EMT标志物。然而，由于大多数 EMT 研究都集中在实验室模型上，因此EMT在原发性肿瘤和转移瘤中的范围和意义仍然存在争议。此外，虽然某些肿瘤的间质亚型已被确定，尚不清楚它们是否反映了间充质癌细胞还是间充质非癌细胞。
● p-EMT是 HNSCC不良临床特征（包括侵袭和转移）的独立预测因子
● 头颈部鳞癌（HNSCC）是一种与酒精和烟草暴露密切相关的多源性的上皮肿瘤。患者往往在晚期出现淋巴结转移（LN），凸显癌细胞转移是核心挑战。研究者研究原发性头颈部鳞状细胞癌和对应淋巴结转移，以更好地了解瘤内异质性，侵袭和转移。来自18位患者的6000细胞的转录谱揭示了区分不同恶性、间质和免疫细胞的表达机制。恶性细胞在细胞周期，应激、缺氧和上皮分化过程中基因表达有所不同。一部分细胞也表达了部分EMT（p-EMT）程序与细胞外基质蛋白，但缺乏经典的EMT转录因子。p-EMT细胞定位于原发癌的边缘，邻近“癌相关成纤维细胞”（CAF）。研究者利用HNSCC生态系统的知识来重新评估来自癌症基因组图谱（TCGA）的RNA-seq数据。这为HNSCC表达亚型的相关研究提供了新见解和思路，并将p-EMT程序建立为不良临床特征（包括侵袭和转移）的独立预测因子。
Results
● 1 HNSCC原发肿瘤和转移瘤的单细胞表达图谱
● 在最初的质量控制后，研究者保留了来自18名患者的5,902个细胞的单细胞转录组。研究者通过三种补充方法来区分2215个恶性细胞和3363个非恶性细胞。首先，研究者根据跨染色体间隔的平均表达谱推断每个单细胞中的大规模染色体拷贝数变异（CNV）。这些推断的CNVs与WES一致，通过推断的CNVs将恶性细胞从正常核型的非恶性细胞中分离出来。
● 其次，研究者通过其上皮来源鉴别恶性细胞，其不同于TME中的基质和免疫细胞。通过小提琴图证实具有上皮标志物表达的细胞和具有异常核型的细胞之间具有显著的一致性，CNVs筛选出的肿瘤细胞上皮化评分高。
● 最后，研究者通过它们的全局表达模式将细胞划分到27个初始簇。基于CNV和上皮标志物分析，绝大多数细胞均被分到具有一致恶性或非恶性分类簇中去。
● 2 头颈部癌症的表达异质性景观
● 非恶性细胞的单细胞概况揭示了肿瘤微环境（TME）的组成。研究者通过它们的表达状态将3,363个非恶性细胞分成八个主要簇。根据已知标记基因的表达，对T细胞，B/血浆细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，成纤维细胞和肌细胞这八个簇进行注释。值得注意的是，每个簇含有来自不同患者的细胞，表明TME中的细胞类型和表达状态在HNSCC肿瘤中基本一致，并且不代表患者特异性亚群或研究者批处理效应，尽管它们的比例是不同的。
● 数据库中T细胞和成纤维细胞数量相对较多，通过更精确的聚类发现了T细胞和成纤维细胞的多样性。
● 主要T细胞簇（约1000个T细胞）可以分为四个亚群，标注为调节性T细胞（Treg），常规CD4 + T辅助细胞（CD4 + Tconv）和两种CD8 + T细胞群（CD8+T细胞和CD8+Tex耗竭细胞）。细胞毒素CD8 +亚型在共抑制性受体（例如PD1，CTLA4(与T细胞功能障碍和衰竭相关的其他基因)）表达方面不同，并由此定义HNSCC中T细胞耗竭程序。这些T细胞表达状态可以为理解和预测检查点免疫疗法的反应提供帮助。
● 尽管研究人员对人类肿瘤中成纤维细胞有很大的兴趣，但其调节机制尚不明确。约1,500成纤维细胞分成3个子集：两个主要子集+一个次要子集。
● 一个子集表达肌成纤维细胞的经典标记，包括α平滑肌肌动蛋白（ACTA2）和肌球蛋白轻链蛋白（MYLK，MYL9）。肌成纤维细胞是TME的已知组分，并与伤口愈合和伤口挛缩有关。第二个子集表达与癌症相关的成纤维细胞（CAFs）的受体，配体和细胞外基质（ECM）基因（肿瘤内 CAF 异质性、CAF 参与 TME 中复杂的结构和旁分泌相互作用），包括成纤维细胞活化蛋白（FAP），podoplanin（PDPN）和结缔组织生长因子（CTGF）。第三个子集基本不包括肌成纤维细胞和CAF的标记物，定义为静止状态的成纤维细胞。
● 进一步的分析将CAF分为2种类型：CAF1和CAF2。CAF1类型表达COL1A1，间充质标记（例如VIM，THY1）和ECM蛋白（例如MMP11，CAV1），而CAF 2类型表达immediate early response基因（例如JUN，FOS），配体和受体（例如 FGF7，TGFBR）。有趣的是，他们还发现来自淋巴结的成纤维细胞富含肌成纤维细胞和CAF1亚群。
● 2215恶性细胞根据其上皮起源聚类。个体肿瘤中检测到超过2000个基因有表达上调。
● 不同肿瘤患者的上调和下调基因染色体拷贝数变异上升率完全不同，提示肿瘤异质性是非常丰富的，基因上调下调差异与肿瘤亚型有关（参见以下通过大量表达数据解卷积精制的HNSCC亚型）。
● 例如，在研究者的队列中，与解毒和药物代谢有关的基因（例如，GPX2，GSTM，CYP，ABCC1）优先在两种个肿瘤患者6、20号表达。代表这个是一个独立的肿瘤亚型。
● 最后，其他差异表达的基因与应激（例如JUNB，FOSL1，P25）或免疫激活（例如IDO1，STAT1，TNF）有关，可能对不同的TME有不同反应。因此，肿瘤间恶性细胞表达异质性反映了研究者队列中肿瘤之间遗传学，亚型和TME的差异。
● 3 恶性肿瘤瘤内表达的异质性
● 对10个肿瘤样本中的每一个都应用该方法，共定义了60个细胞特征。接下来，研究者使用层次聚类分析得到肿瘤常见表达程序。可以归类为六个表达程序。
● 七个表达程序优中两个程序反映了细胞周期的G1 / S和G2 / M期（图 3A 和 3B 中的簇 1 和 2），并在每个肿瘤中鉴别出周期细胞（14％-40％）。第三个程序包括JUN，FOS，以及涉及细胞激活和应激反应的早期基因（图 3A 和 3B 中的簇6 ）。第四个程序富含缺氧反应相关基因（图 3B、S3A）。五、六个程序（图 3A 和 3B 中的簇 4和 5），主要由上皮基因组成，如EPCAM，细胞角蛋白（例如KRT6,16,17，75）和激肽释放酶（KLK5-11）。虽然所有的恶性细胞都表达上皮标记物，但这些特定上皮基因的表达在恶性细胞中是不同的，并且可能反映了上皮分化程度，所以归类为2簇细胞。最终的表达程序包含与细胞外基质相关的基因，并具有EMT的特征，研究者定义为p-EMT。这个程序在所检查的10个肿瘤中的7个细胞亚群中是明显的。
● 4 HNSCC中的p-EMT程序
● 尽管EMT程序被广泛认为是耐药，侵袭和转移的潜在驱动因素，但它们在人类体内上皮肿瘤中的模式和意义仍不清楚。因此，研究者将其定义为p-EMT细胞，一方面是：研究者首先仔细检查了细胞外基质表达程序中的EMT基因表达特征：除ECM基因如基质金属蛋白酶（MMP），层粘连蛋白（LAMC2）和整合素（ITG）外，该程序还包括EMT标志物波形蛋白（VIM）和整联蛋白α-5（ITGA5）。
● 此外，该类细胞程序中得分最高的基因之一是转化生长因子（TGF）β诱导（TGFBI），暗示TGF-β调节该类细胞的EMT程序。
● 另一方面是：虽然该程序具有经典EMT的关键基因表达特征，但缺乏EMT的细胞标志。
● 首先，虽然特征伴随着某些上皮基因的表达降低，但是上皮标记物的总体表达还是明显地保持下来。八个与 p-EMT 评分呈负相关的上皮基因 (D) ，六个与 p-EMT 评分不相关的上皮基因 (E)。
● 其次，研究者没有检测到经典EMT转录因子：ZEB1 / 2，TWIST1 / 2和SNAIL1的表达。只有SNAIL2被检测到（在70％的HNSCC细胞中）(F)。最近的研究表明SNAIL2比其他EMT 转录因子出现较早。研究者查阅相关文献注意到，EMT越来越被认为是一个连续和变化的过程。因此，研究者建议将体内肿瘤EMT程序定义为p-EMT。
● 几个额外的分析表明，这个p-EMT程序不同于源自细胞系和肿瘤模型的完整EMT程序，以及源自肿瘤的肿瘤谱间充质特征。
● 5 体外p-EMT细胞是动态的和入侵性的
● 研究者通过5个HNSCC细胞系进一步研究了p-EMT程序的功能意义。10个肿瘤患者的501个p-EMT程序细胞之间相关，细胞系之间具有基因表达相关性，说明p-EMT程序细胞的表达谱与人类肿瘤大不相同。
● 接着研究者把5个HNSCC细胞系分别送测序获得基因表达特征，结果发现SCC9细胞株（口腔来源的细胞系）中的一部分优先表达了体内p-EMT程序（用于分类实验的标记（TGFBI、CXADR）以粗体显示）。而 SCC25 包含一个表达谱类似于应激程序的亚群。
● 基于 TGFBI 表达分离的 p-EMThigh 和 p-EMTlow SCC9 细胞株。当通过流式细胞术分离这些高p-EMT细胞时，它们呈现出增强的侵袭性。
● 它们的增殖速率也降低，与患者样本的scRNA-seq分析及之前的EMT研究一致。
● 先前的研究表明EMT的早期阶段可能是过渡性的。因此，研究者猜想更多上皮细胞亚群中，p-EMT是否可以在动态平衡中，呈现出相对静止状态。为了测试这个，研究者将来自SCC9的高p-EMT和低p-EMT细胞分类，培养它们，并重新评估标记物TGFBI表达。两个群体在分选后 4 小时和 24 小时保持不同（t 检验，p < 0.0001；图 S4H）但在培养 4 天后变得无法区分。说明这种体外p-EMT程序的是动态平衡变化的，细胞此时表达p-EMT程序多，可能过一段时间就表达p-EMT程序少。作者由此猜想体内 p-EMT 程序在肿瘤组织中会不会有一个相对静止状态，动中有静。
● 6 p-EMT细胞定位于靠近CAF的前沿（组织层面）
● 综上所述，研究者的体内图谱和体外功能数据表明，p-EMT程序是动态的，可能对肿瘤微环境有响应。研究者于是进一步探究HNSCC肿瘤内表达p-EMT程序细胞的肿瘤空间定位。研究者在对肿瘤组织进行一系列p-EMT程序优先表达基因免疫组化染色（PDPN，LAMC2，LAMB3，MMP10，TGFBI和ITGA5），以及HNSCC标记物p63。这些实验揭示了一组恶性细胞共同染色的p-EMT标记物，并定位于肿瘤与周围基质紧密贴合的肿瘤前缘。
● 通过scRNA-seq的缺乏p-EMT程序的肿瘤不染色这些标记物。
● 相反，上皮分化标志物（SPRR1B，CLDN4）染色位于肿瘤的核心。
● p-EMT程序定位于肿瘤前沿促使研究者考虑其与TME的相互作用，如配体受体信号传导。研究者推测基于一种细胞类型的配体和另一种细胞类型的相应受体的表达推定的肿瘤-基质相互作用。这个预测的“外向”信号以相似的比例从恶性细胞向各种TME细胞类型发出信号。相反，当研究者考虑对恶性细胞“传入”信号时，研究者发现CAFs表达显著更高数量的配体对应于恶性细胞表达的受体。认为CAFs显著释放了“内向”信号。
● 研究人员对进行了 CAF 标记（FAP、PDPN）染色，我们发现CAFs 存在于前缘的 p-EMT 细胞附近。
● 为了评估配体-受体相互作用的功能意义，研究者用TGF-β处理SCC9细胞。暴露4小时激活了类似p-EMT的程序，其在抑制TGF-β时被抑制（热图描绘了当SCC9 细胞用 TGF-β或 TGF--β通路抑制剂处理时差异调节的基因的相对表达，每组九个样本。小提琴图描绘了(G)处理后通过 scRNA-seq 分析的 SCC9 细胞中 p-EMT 基因表达评分的分布，p-EMT 评分随着 TGF-β处理而增加，并在 TGF-β抑制后降低）。
● Tgf-β处理也增加了侵袭性并减少了增殖，而抑制作用具有相反的效果。
● TGFBI（TGF-β的靶基因和p-EMT优先基因）过度表达导致SCC9细胞对侵袭性和增殖的类似影响。（F、G）
● 相反，研究者设计3个TGFBI 的基因敲低细胞株，抵消了TGF-β 反应。（P）
● 研究者试图在共培养中测试来自原发肿瘤的 CAF是否影响临近的肿瘤细胞p-EMT，但我们发现培养的成纤维细胞失去了典型激活标志物和配体的表达（F）并且未能在共培养的癌细胞中诱导 p-EMT 反应。作者在此合理猜测：CAF 和恶性细胞之间的旁分泌相互作用可能促进了 HNSCC 肿瘤前沿的 p-EMT 程序，在肿瘤侵袭中具有潜在作用。
● 7 肿瘤内HNSCC异质性在局部转移中的研究进展
● 为了进一步了解潜在的HNSCC扩散的决定因素，研究者将LN转移与原发性肿瘤进行了比较。（尽管全外显子组测序WES和推测的CNV显示了原发性和匹配的LN样本之间的存在一些基因组差异，但是可能是由于所研究的个体数量较少，他们没有鉴别出任何一致的区别。）
● LN中恶性细胞的表达谱也与原发肿瘤大致匹配。
● 在每个配对样本中，都有显著表达的差异基因，但是它们在整个群体（cohort）中不一致。（Sig：p < 0.001 和 染色体拷贝变化> 2；Bor: p < 0.05 和染色体拷贝变化> 1.5）
● 尽管在不同患者的p-EMT评分不同（5,28,25高），但每个患者的原发肿瘤和淋巴结转移中p-EMT评分是一致的。并且p-EMT评分较高的肿瘤，肿瘤内p-EMT变异度也较高。
● 这些发现提示肿瘤及LN转移的p-EMT程序是动态yizhi变化的。
● 研究者还观察到淋巴结和原发性肿瘤在间质细胞和免疫细胞的特征和表现的总体一致性。大多数簇含有来自两个位点的细胞，但仅在原发性肿瘤中观察到了肌细胞，并且仅在LN中发现了B /浆细胞。
● 成纤维细胞亚型也不同地表示：LN成纤维细胞富含肌成纤维细胞和CAF1亚型。这些结果提示患者淋巴结转移的肿瘤微环境信号是动态变化的，但研究者还是认为TME在原发肿瘤和转移淋巴结之间 “大同小异”。
● 这些发现促使研究者使用上述标记物检查LN标本的组织学形态。研究者发现大部分具有p-EMT标记细胞在完整上皮结构或恶性细胞的“巢”的外围。
● 这些观察结果与“集体迁移”模型一致，恶性细胞和基质细胞以团簇形式移动，淋巴源性扩散并形成LN转移灶。或者，单个细胞可能在团簇移动的同一部位播散和植入（“单细胞播散”），从而在LN转移瘤内重现原发肿瘤的异质性。
● 8 通过大量表达数据去卷积改良的HNSCC亚型分型
● 研究者接下来考虑了从scRNA-seq数据鉴定的肿瘤表达程序的预后意义。最近的TCGA研究分析了数百个HNSCC肿瘤的表达谱，并将它们分为四个亚型：非典型(24%)、间充质 (27%)、基质型(31%) 和经典型 (18%)。
●（作者对Walter2013文章数据库和TCGA数据库mRNA挖掘，按728 个预测基因排序，HNSCC肿瘤的表达谱，并将它们分为四个亚型。进一步在自己的279例样本的mRNA数据库中分析基因组和信号通路，其中口腔癌172例，口咽癌33例，喉癌72例，喉咽癌2例。36例为HPV（+），243例为HPV（-）。）
●（Cancer Genome Atlas Network,Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas.[J] .Nature, 2015, 517: 576-82.）
● 考虑到TCGA分型是基于大块肿瘤细胞获取的基因表达，所以作者认为由单个细胞表达程序能对肿瘤分型有一个更深刻的认识。作者认为单个肿瘤的单细胞表达谱大数据定义的分子亚型是否能更好的反映恶性程度、恶性细胞组成或 TME 组成的差异。
● 研究者首先确定了十个HNSCC肿瘤的TCGA表达亚型。研究者评估了每个肿瘤的恶性细胞与其亚型表达特征的对应关系。引人注目的是，每个肿瘤清楚地映射到三个亚型之一：基底型（n = 7），经典型（n = 2），或非典型（n = 1）。没有一个恶性细胞映射到间充质亚型。然而，评估了基质和免疫细胞与其亚型表达特征的对应关系时，发现CAFs、肌成纤维细胞和肌细胞映射到间充质亚型。
● 这一发现提出了TCGA间充质亚型反映大批量样品中的基质细胞而不是恶性肿瘤细胞。实际上，分析鉴定TCGA样品中间充质亚型肿瘤高度表达对CAF和肌细胞特异性的基因。
● 此外，当研究者检查TCGA的HNSCC肿瘤的组织学切片时，鉴定到间充质肿瘤的成纤维细胞比基础型肿瘤多大约2.7倍。
● 这样分析下来，间充质亚型就不是恶性肿瘤细胞的一种独立亚型，
为了进一步研究TME组分对TCGA分类的影响，肉眼看间充质亚型中间充质肿瘤的成纤维细胞比基础型肿瘤多大约2.7倍，所以这里有个恶性细胞丰度太低的问题，所以研究者设计了计算方法消除了细胞类型频率（包括恶性细胞频率（即纯度））的影响。重新推断了每种TCGA肿瘤的恶性细胞特异性内在表达谱。
● 经过统计学处理，研究者认为先前被归类为间充质的肿瘤被发现是先前描述的基质亚型（现称为“恶性基底”）的一部分。
● 因此，研究者建议可以将HNSCC肿瘤细化为恶性细胞的三种亚型（基质型，典型和非典型），其中合并的恶性-基础亚型特别普遍，在TCGA中口腔肿瘤的占比> 70％，与研究者队列中十个肿瘤中的七个的分类一致。
● 9 p-EMT预测转移和不良病理学特征
● 纳入TCGA数据使研究者有机会在更大的队列中研究p-EMT程序的普遍性和重要性。
● 在研究较小的样本群体中，p-EMT程序在来自10个肿瘤中的7个的细胞中明显，这与7个完全对应到恶性基底亚型的肿瘤。
● 与研究者较小的队列一致，TCGA中恶性基底肿瘤中的p-EMT水平最高。
● 此外，恶性基底TCGA肿瘤（all malignant-basal TCGA tumors (n = 225)）的主成分分析显示前两个成分与p-EMT基因的表达相关，并与上皮分化基因呈负相关。
● 值得注意的是，从大量表达数据的这些无偏分析定义的p-EMT程序与研究者的scRNA-seq分析所定义的高度一致。
● 他们独立证实了人肿瘤中的体内p-EMT状态：除了SNAIL2之外的经典EMT TFs的缺失（具有经典EMT的关键基因表达特征，但缺乏EMT的细胞标志）。
● HNSCC肿瘤的淋巴源性扩散形成LN转移是疾病负担和死亡率的主要来源，手术中往往要清扫淋巴结站，并且具有不良预后特征例如包膜外延伸或淋巴血管浸润的肿瘤，还需接受放化疗等辅助治疗。因此，研究者测试了体内p-EMT标记是否可以预测恶性基底肿瘤中不利的病理学特征或疾病结果。
● 研究者发现，高p-EMT评分与LN转移的存在和数量以及更高的淋巴结分期有关（高的 p-EMT 评分与阳性淋巴结、转移淋巴结数量、晚期淋巴结分期、III期、包膜外延伸 (ECE) 和淋巴血管侵犯 (LVI) 相关）。
● 研究者注意到肿瘤分期关联，III期肿瘤中高p-EMT评分占比更多，提示其侵袭性更强。有趣的是，p-emt与原发肿瘤大小无关，说明其与侵袭和转移直接相关，而与肿瘤生长无关。
● TCGA 肿瘤中，具有多个 LN 的恶性基底与没有阳性 LN 的肿瘤之间的基因表达差异，发现p-EMT基因是与淋巴结转移的最高相关基因之一，而诸如细胞周期或缺氧的其他程序基因则几乎没有强相关性。相反，上皮分化程序与转移呈负相关。重要的是，与CAF 频率相比，p-EMT 程序更能预测淋巴结转移和局部浸润（图 S7I）。
● 目前的临床实践依赖于不完美的淋巴结转移的预测因素，如肿瘤的厚度和大小，导致不必要的颈淋巴切除率很高（> 80％）。p-EMT评分有助于预测淋巴结转移，指导临床诊疗方案。
Summary
● 肿瘤中多种多样的恶性细胞、基质细胞和免疫细胞会影响肿瘤生长、转移和治疗。● 课题组分析了18名头颈部鳞癌(HNSCC) 患者的 6,000 个单细胞的转录组，包括5对匹配的原发性肿瘤和淋巴结转移。● 基质细胞和免疫细胞在患者之间具有一致的表达程序；相反，恶性细胞在肿瘤内和肿瘤之间在与细胞周期、应激、缺氧、上皮间质转化 和部分上皮间质转化 (p-EMT) 相关的特征表达方面有所不同。● 表达p-EMT程序的细胞在空间上定位于原发性肿瘤的前沿。通过将单细胞转录组与数百种肿瘤的大量表达谱相结合，我们根据其恶性和基质组成细化了HNSCC亚型，并将p-EMT确立为淋巴结转移、分级和不良病理类型的独立预测因子。● 总之，本文提供了HNSCC生态系统全景，细化了HNSCC的RNAseq亚型并定义了转移相关p-EMT 程序。
往期回顾
文献阅读（一）、人类肠道微生物的代谢网络与疾病
文献阅读（二）、肥胖与减肥干预状态下的肠道微生物组及血清代谢物变化
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文献阅读（四）、单细胞测序技术解析健康人与T2D患者的胰岛差异
文献阅读（五）、只有5页的文章（IF=7.307）
文献阅读（六）、小鼠全肾单细胞测序开篇之作
文献阅读（七）、一篇不花钱就能白嫖的文章文献阅读（八）、不会吧不会吧，Nature都能白嫖？文献阅读（九）、一文了解GSVA原理
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