2019版软组织和骨肿瘤分子专家共识及新型分子检测技术

 众所周知，软组织肉瘤和骨肉瘤发病率低，但诊疗难度较大，多数病理医师缺乏诊断经验，免疫组化辅助诊断抗体很少，使病理医生常感困惑。随着分子检测技术的发展，特别是高通量测序技术（NGS）的发展和广泛应用，软组织肉瘤和骨肉瘤相关分子事件的发现和研究也逐步深入和细致化，软组织肉瘤和骨肉瘤逐渐可以使用分子手段来辅助诊断。在这一背景下，中华医学会病理分会骨和软组织疾病学组、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会骨与软组织疾病学组和中国抗癌协会肉瘤专业委员会病理学组组织专家编写了第一版《软组织和骨肿瘤分子病理学检测专家共识（2019年版）》，旨在规范分子病理学检测在软组织肿瘤和骨肿瘤领域内的应用。

概括来说，软组织肉瘤和骨肉瘤主要的分子病理改变包括：基因突变、丢失、扩增、融合（重排）、染色体易位以及染色体不稳定等。其中融合（重排）事件的检测（特别是未知融合类型的检测）是检测重点和难点。荧光原位杂交法（FISH）、荧光定量PCR（RT-PCR）/桑格测序法（Sanger）、免疫组化法（IHC）等常规使用的方法在检测基因融合（重排）时，各有优点，但在均存在一些难以克服的问题。

项目	IHC	FISH	RT-PCR	NGS
灵敏度	5%-10%	10%-15%	1%-5%	1%-10%
检测费用	低	高	高	高
可检测的融合型	所有融合型但不能区分	所有融合型但不能区分	已知的融合类型	所有融合类型，确定融合伙伴和融合断点
操作要求	简便，几乎所有病理科医师均可诊断	高，需经过培训且有经验的医师判读结果	简便，但需特定的试剂盒及仪器	复杂，且需要特定试剂盒及仪器和专业人员
所需样本量	厚度3-5μm的石蜡切片	厚度3-5μm的石蜡切片	100-500ng的RNA	50ng以上DNA  或30ng以上RNA
优点	操作简便、价格便宜	特异度高	操作简便、灵敏度高	特异度高、灵敏度高、检测全面，可检测未知融合
不足之处	判定结果存一定主观性、无法直接检测融合基因，当IHC结果为2+时，需要用FISH检测确证	操作要求高、价格昂贵、尚不适用于疑似融合阳性患者的筛查	无法检测未知的融合类型、对RNA质量要求高	操作要求较高，价格较高，检测耗时较长，需要专业生物信息人员分析数据

表1.检测融合变异的免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR(RT-PCR)与高通量测序(NGS)检测方法的比较。

相比之下NGS的一些优点显得尤为突出：①NGS技术不仅灵敏度高而且覆盖的范围广。②NGS方法支持多重检测，能轻易地进行扩展，提高了临床检出效率。③在检测基因融合（重排）变异时，其他的方法不能或较难鉴定融合伙伴和融合断点，几乎不能发现新型融合。对已知的融合类型，也难于区分不同的变体亚型，而越来越多的研究证明了融合变体亚型会影响相关肿瘤的生物学特征并影响药物治疗疗效。

值得注意的是，《软组织和骨肿瘤分子病理学检测专家共识（2019年版）》中推荐了几个新型的分子检测技术，共识中列出的有：单核苷酸多态性阵列、基因表达微阵列分析、RNAseq、基于锚定多重PCR的靶向NGS和基于荧光的NanoString nCounter等。这些新的分子检测技术，有助于发现软组织肿瘤中新的基因异常，对软组织肉瘤的分子诊断和潜在的靶向治疗具有重要的价值，共识指出，有条件的单位应积极开展所推荐的新型分子检测技术。

在共识所推荐的新型分子检测技术中，这里重点介绍一下“基于锚定多重PCR的靶向NGS的技术”，该技术是由恒特基因的首席科学家郑宗立博士在哈佛麻省总医院工作期间，为解决检测基因融合（重排）的困难，克服传统方法FISH、IHC及RT-PCR的一些固有缺陷而发明的。锚定多重PCR技术成为哈佛麻省总医院广泛使用的NGS肿瘤基因检测技术。于2016年底正式获得USPTO专利保护，并由麻省总医院独家授权给ArcherDx公司进行商业推广。锚定多重PCR技术在多年推广后，其先进性已为行业所公认，ArcherDx公司使用基于锚定多重PCR技术开发的相关Panel，发现了包括软组织和骨肿瘤病例在内的大量新型融合变异类型的病例。

图1. 基于锚定多重PCR技术开发的融合检测Panel在2018年中发现了13个新型融合类型。

图2. 基于锚定多重PCR技术开发的肉瘤检测Panel发现的新型COL1A1-PDGFB融合变异。

郑宗立博士归国后，于2016年创办了深圳恒特基因有限公司，为克服锚定多重PCR技术的一些局限，开发了另一个技术－PANO-Seq®，对微量核酸具有更高的检测灵敏度，且在一个反应管中同时进行DNA和RNA建库，全面完成5种突变类型（点突变、插入缺失、DNA拷贝、融合、RNA表达）的检测。PANO-Seq®为恒特基因拥有完全自主知识产权的技术，已经申请国际国内专利。PANO-Seq®的技术优势如下：

1. 全球首创的DNA和RNA两种起始模板单管建库（同一反应体系完成），获得更多有效数据的同时，极大的提高了效率，降低了成本；

2. 全面覆盖SNV、indels、Fusions、CNVs和Expression的变异类型；

3. RNA重点检测融合基因突变和过表达变异；

4. 对未知融合基因变异的检出非常强大，能够检测出未知的基因融合突变类型，无需预知融合伙伴和断点；

5. 同时检测DNA和RNA，包含更多有临床意义的信息；检测结果相互验证，最大程度保证检测结果真实可靠。

参考文献：

1. https://www.91360.com/201901/76/1105.html.

2. https://archerdx.com/

3. Molecular analysisof gene fusions in bone and soft tissue tumors by anchored multiplex PCR-basedtargeted next-generation sequencing. The Journal of Molecular Diagnostics,2018,20(5):653-663.

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