Western blot最全避坑指南

Western blot作为蛋白定量的一种方法，在实验室具有不可动摇的地位。基础实验中，几乎每篇文章都会有western blot的图，但是western blot历时时间长，每一步都有可能出错，笔者和身边的小伙伴觉得我们的经验踩过的坑都可以写一本书了。今天就探讨一下实验中可能会出现的问题，大家引以为戒。

蛋白定量

蛋白定量注意两点：

第一、①BSA浓度要从5mg/ml配到1mg/ml或者2mg/ml，如果你做蛋白定量每次你的蛋白都低于最小值，那很有可能就是BSA浓度没有稀释，导致最后的蛋白浓度肯定是会小于最小值的。我曾经一天做过三次BCA，都小于最小值，都快怀疑人生的时候，才想起来可能是这个原因，最后试了一下果然是的。

②超声的时候，因为超声发热损伤蛋白，我们一般会把要超声的样本放到冰水混合物里，如果超声的时候有冰块掉进去的话，也会导致蛋白浓度过低。

③收取细胞的时候，一般是用PBS冲两遍，如果PBS没有吸干净，可能也会导致蛋白浓度过低。

第二、煮蛋白的时候一定要将盖子扣紧，最好还是用进口的EP管，不然的话EP管崩掉就惨兮兮了（我眼睁睁看着它在我眼前崩开）就没有定量的意义了。

Tips:有很多课题组会不进行蛋白定量，会用Image J 做个蛋白定量条形图的分析，发过文章的人都知道，western的定量图都很大程度上有主观意识在里面，你可以自行删减一些比较跳的数据，所以我建议还是提前做定量，最后也可以省时省力。

正式开始跑胶

配胶

1、夏季配胶注意温度的影响，在灌了浓缩胶之后要立即插上梳子，否则上层胶如果快要凝固，就算最后拔完梳子，上样的时候多半也会飘。如果是冬天，可以把胶放到37℃孵箱里，那样可以节省胶凝固的时间。

2、梳子注意匹配好1.5mm的和1mm的板子，1.5mm的多半也插不进去1mm的，但是如果1mm的梳子插到了1.5mm的梳子里面，由于中间有空隙，就会有胶凝固在里面，上样一定会飘。

3、然后就是胶的浓度：

80~140kd的多用8%

25~80kd的用10%

15~40kd的用12%

＜20kd的用15%

上样

1、上样一定注意不要配错buffer！上样一定注意不要配错buffer！上样一定注意不要配错buffer！（重要的事情要说三遍）之前有个师弟帮一个师姐配胶，把SDS的浓度搞错了，导致师姐的胶跑出来marker是异常分开的，浪费了样本，师姐过来看的时候是崩溃的。

2、还有就是电泳槽的内槽，上完样以后记得加满buffer，不然的话，蛋白跑到一半的时候就会停住不跑了。因为running buffer里面有一些离子是起着类似于导电的作用，如果水加不满，就可能会导致不通电，它就会停住不跑了。

3、不要暴力拔梳子，上层胶凝了一会就可以泡到running buffer里，不然可能会导致梳子不太好拔，如果暴力拔梳子，会导致板子裂掉。（别问我为什么知道）

转膜

转膜可讲的就太多了，我可是一个在转膜上兜了半个学期的loser，多谢师姐不弃，拉我出坑。

1、buffer一定要配的对，并且还要敏锐地感觉到自己有没有倒错buffer（这句话看起来有点傻），但是我记得我有一次倒完buffer以后赶气泡的时候，怎么赶气泡都赶不完，后来一看，傻掉了，倒成了running buffer，因为我当时想起来，可能是SDS产生的泡沫，但是transfer buffer里面是没有SDS的，是不可能有气泡的。

2、转膜的时候一定要夹紧夹子，虽然是3+3的滤纸海绵结构，但是宁愿紧一点，不要松一点，松一点极有可能是转不上的。可以增加海绵的厚度，也可以多加两块海绵，但是多加滤纸的时候要小心，因为由于滤纸的质地和材质不一样，可能会导致滤纸的电阻比较大，需要延长转膜时间才可以，这个还是需要前期摸索的，在增加滤纸之前记得去网上查一下，不要盲目自信。（自然也是吃过亏的）

3、夹三明治结构的时候可以多加水，没过膜和胶，这样有助于减少气泡。

4、注意转膜温度的控制，可以提前将transfer buffer放到4度冰箱，等用的时候取出来，就会像冰镇西瓜一样，冰到你心里，然后外围再加冰水混合物，如果觉得天气太热冰容易融化的话，还可以放两个冻好的冰袋，一般这样就可以保证转膜的时候不会烧膜，万无一失。

5、转膜液配置的时候，甲醇浓度20%。

6、转膜的时候，海绵要比滤纸大，滤纸要比胶大，PVDF膜或者NC膜，要比胶大。但是大小不要超过海绵。

封闭

我们常用的是5%的脱脂奶粉，但是如果你做的蛋白不太好做，也可以尝试用BSA封闭。

孵育一抗二抗

1、这个没有过多的说的，但是建议孵育抗体之前看一下说明书，这个抗体建议的稀释比，以及抗体的种属来源，尤其是帮师兄师姐干活的时候，不太清楚的抗体一定记得查说明书，western一共做下来，这么久了，在孵育抗体的时候出错的话，师兄师姐多半也会崩溃的。

2、蛋白表达量少不太好做的话可以尝试用5%的牛奶稀释抗体，或者用5%的血清稀释抗体。

3、孵育一抗的盒子一定记得洗干净，因为会有其他抗体的残留，从而导致你的条带会出现干扰条带。

显影

1、显影液虽然有点贵，但是该用还是得用，如果你的膜是这样的：

那么很有可能就是显影液没有覆盖到你膜上的有些地方。

2、曝光内参的时候，如果显影液是超敏的，可以考虑稀释一下，然后曝膜的时候从毫秒开始起曝，不然过曝了就没有意义了。

碎碎念：

1、一般western的内参会洗膜以后再去孵育内参的抗体，这样比较可信。

2、如果你的蛋白条带相差比较大，还可以把膜剪开，分开孵育抗体，多的甚至有剪三条的，在同一张膜上分开孵育也更具有说服力。

3、内参比较灵敏，有时候会连成一条线，这个时候可以尝试减少上样量，我做细胞的话，一般每孔上样20ug就可以了，内参跑出来还可以。

最远的套路莫过于western的套路，尝试去了解实验背后的原理，就可以知道自己所做的每一步是否还有挽救的余地，每个实验都是如此，致自己，也给你们，希望你们可以跑出漂亮的条带！

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封面图来源于网络

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