每个微小念头都是大脑的盛大演出，现在科学家找到了“入场券”

原文作者：Giorgia Guglielmi

单个神经元的膜电压读取将如何驱动神经科学的下一场革命？

2010年，生物物理学家 Adam Cohen在旧金山漫步的时候接到了一个意外的电话。 “我们看到了信号！”电话那一端说。在距离旧金山约5000公里的马萨诸塞州剑桥，Cohen的同事已经有了关键的发现。经过几个月的失败，研究人员终于发现了一种荧光蛋白，通过这种荧光蛋白他们可以观察到神经元之间的信号传递。

插图作者：Joanna Gebal

然后诡异的事情发生了。Cohen回到哈佛大学实验室之后了解到所有的实验记录都呈现出奇怪的发展趋势。起初，当电信号传递时，表面用荧光蛋白标记的神经元都顺利发光了。但过了一段时间神经元细胞就会变成明亮的斑点。 “每次实验进行到中途，我们的信号蛋白就完全不受控制了。” Cohen说。

所以他决定亲自参与一次实验。“当实验开始的时候，他们会坐在那里，连气都不敢喘。”科恩说。但是一旦他们意识到荧光蛋白发挥作用了，他们就开始欢呼庆祝，“在房间里跳舞，跑来跑去。”

他们在狂欢中，把台灯的光线照到显微镜上。 “我们的实验实际上记录了我们的兴奋。”当时Cohen团队中的一名研究生Daniel Hochbaum说。之后他们在庆祝时有所收敛。一年之后，Cohen团队发表了他们的研究——这是将荧光蛋白导入特定哺乳动物神经元实现实时跟踪电信号传递的最早研究之一。

几十年来，神经科学家一直试图观察大脑语言的主要组成部分——传递极为迅速的电信号。虽然电极片能够测定电压，可靠地记录单个神经元的活动，但却很难同时捕捉很多信号，尤其是在观察时间较长的情况下。

而在过去的二十年里，科学家们找到了能够将荧光蛋白直接嵌入神经元细胞膜的方法，这种荧光蛋白可以指示电压大小。通过合适的显微镜，科研人员能够在神经元细胞进行信号传递的时候观察到细胞亮起来——无论信号强弱，无论是“窃窃私语”还是“摇旗呐喊”。电压成像能够同时记录许多神经元之间的电信号，然后将大脑组织不同区域的信号进行平均。Cohen说，这有助于研究人员在不同空间层面上研究大脑的电活动，不仅能听到单个细胞的“私语”，也能听到“群体的咆哮”。

在过去的5年里，科研人员就这一主题已发表了约1000篇论文，一些主要的资助项目，如美国国立卫生研究院的BRAIN计划，进一步加快了新型基因工程电压标志物的开发。为找到更加合适的标志物，一些研究小组提出了以特定特性（如亮度）为目标筛选数百万种蛋白质的策略。其中一种方法已经找到了新的蛋白，它的亮度是4年前发现的标志物的2倍。

随着这些蛋白质特性的不断优化以及显微镜技术的进步，科学家希望能够阐明神经科学最大的难题：大脑的细胞是如何协同工作，将电脉冲系统转化为思想、行为和情感的。研究人员仍在努力捕捉全方位的大脑活动，设法观察脑组织内深部神经元的快速激活。如果未来的进步可以解决这些技术挑战，“那将会是革命性的。”哥伦比亚大学的Rafael Yuste说。他的研究方向是神经回路功能。

神经元电信号传导速度极快

人类大脑平均包含大约1200亿个神经元，它们不断地通过被称为树突的分支结构接收和发送信息。到达树突的化学或电信号会在细胞膜上引起小小的电压变化，这种电压变化会向细胞体传递。当电压变化的总和达到一个激发水平（又称为阈值）时，神经元会释放一个电高峰，即一个动作电位。这一动作电位会沿着神经分支（被称为轴突）以高达每秒150米的速度传导，从这里，信息会以化学信号或电信号的形式传递给下一神经元的树突。

神经元信号积聚、发散、协同，从而产生各种思想、情感、动作和反应，包括一瞬间脸红和婴儿打嗝等。但是科学家的观察工具非常有限。20世纪40年代，像头发一样薄的微型电极被开发出来，它们可以插入大脑，抵着神经元甚至进入神经元内部，精确快速测量膜电压。

但是这种方法只能同时监测一个或几个神经元，且监测时间有限，因为电极最终会对细胞造成损伤。这就像试图通过观察一个乐手几秒钟来了解整个管弦乐队的编排要领一样。

多个微电极可以同时记录多达200个细胞的电活动，但由于这些电极只是靠近而非进入神经元内部，它们只能检测到动作电位，即电活动中最尖锐的高峰，对于未达到这一水平的电信号或者说未能引起动作电位的电压变化则无法检测到。这些亚阈值的电压变化对大脑功能十分重要，因为正是这些电压变化逐渐累加决定了神经元是否产生动作电位。

为了检测大脑中更多细胞更低强度的电活动，科学家从20世纪60年代开始研究感应到电信号就会发出荧光的传感器或者探头物质。运用最广泛的被称为钙指示剂。在发生动作电位时，钙离子会流入神经元细胞内，这些指示剂与钙结合时会发出荧光。

但这种钙成像技术仍然只是间接反映而非直接记录膜电压。虽然钙指示剂能够反映动作电位等强度较大的信号，但它会忽略其它一些对大脑功能至关重要的事件，如膜电压的细微波动或抑制动作电位的电信号。就好比我们只听到了交响音乐会之后的掌声：很明显，表演已经进行过了，但乐队演奏的是什么却没人知道。

20世纪70年代，科学家们开始开发染料传感器，直接检测膜电压的变化。最早这类传感器必须不加选择地涂满整个大脑，这也意味着它们会标记所有细胞类型，包括非神经细胞；在这种情况下，要解析特定神经元的活动就十分困难了。

随后在20世纪90年代，研究人员开始测试可以通过基因工程标记特定神经元的指示物。第一个基因工程编码电压指示器（GEVI）于1997年被开发出来；自那以后，科学家们已经制造了二十多个传感器。其中有些是将电压敏感蛋白与荧光分子结合起来制成的（参见“荧光感受器”）。当这些蛋白质检测到电压的变化时，它们会改变自己的三维结构以及它们偶联的分子的荧光。

还有的电压指示器是微生物视紫红质突变体，这种荧光分子感应到光时会引起细胞膜上的电压变化。这种蛋白也可以反向工作，即根据膜电压变化产生对光的反应，即发出荧光。

微小的信号同样不容忽视

到目前为止，GEVI已可以成功检测单个神经元细胞的动作电位，无论这个神经元是在培养皿中培养的还是在昆虫、老鼠等多种动物完整的大脑中。Cohen 表示，这项技术最大的潜力在于它不仅可以记录动作电位这种大事件，还可以记录膜电压微小的亚阈值变化，这些膜电压变化反映了神经元从相邻细胞接收的信息。“电压成像可以让你在体内环境看到神经元接收的信息，这在以前是无法实现的。”

在过去的一年中，Cohen和他的同事开发了新的GEVI并改进了显微镜技术，以便同时记录多个神经元的亚阈值电压变化，甚至是在小鼠大脑内。他的团队还实现了记录时间的延长，现在他们能够对同一个神经元的电活动进行长达一周的观察。

麻省理工学院的神经科学家Ed Boyden认为，能够确切地知道正在被记录的神经元并进行持续追踪有助于研究人员观察到神经元之间的联系。Boyden说，这样“你就可以将大脑的结构与功能联系起来，这是所有神经科学的核心问题之一”。

GEVI的另一个优点在于，与主要记录来自细胞体的信号的电极片不同，GEVI可以记录神经细胞任何部分的电信号，直至树突尖端（参见“GEVI的‘多层面’能力”）。这就像是能够专门听到钢琴家左手演奏的音符。“这是我长期以来一直梦寐以求的事情，还有许多人和我一样。”加拿大拉瓦尔大学神经生物学家Katalin Toth说。许多神经科学家正在努力实现对整个神经元的电压检测，以了解细胞不同区域的电压变化。

芝加哥大学的神经生物学家Wei Wei正在使用GEVI研究小鼠的视网膜神经元是如何整合不同的电信号输入的。Wei的研究对象是那些对正在移动的视觉刺激最为敏感的神经元。她希望通过观察这些神经元不同区域的膜电压变化，了解神经元细胞是如何整合输入信号来辨别刺激运动方向的。

巴黎高等师范学校的神经生理学家Vincent Villette计划使用电压传感器，研究亚阈值电信号的规律波动如何介导小鼠小脑中的神经元协调肌肉活动。“对于细胞如何协同工作仍存在许多未知。”Villette说。

直接观察膜电压变化还能让科学家们了解哪些电信号对神经元放电具有抑制而非触发作用。法国地中海神经生物学研究所的神经生物学家Rosa Cossart表示，由于抑制信号不可能用钙成像等方法进行记录，因此目前人们尚不清楚这类信号是如何影响大脑活动的。

多年来，Cossart一直在使用电极和钙成像，但她现在迫切地想要尝试GEVI。她希望这些传感器能让她在活鼠体中快速同时测量多个神经元（至少50个）的电压。Cossart说，这应有助于理解神经元群是如何通过整合刺激性和抑制性电信号维持那些对大脑发育和功能至关重要的活动的。

巨大挑战

尽管人们对其期待值很高，但让GEVI走进实验室却并非那么容易。以Helen Yang为例，Yang是斯坦福大学的研究生，她决定尝试使用GEVI研究果蝇的视觉系统神经元。但是，在第一次实验中，Yang在显微镜下并没有看到细胞的荧光发生改变，即便是她在果蝇眼睛前照射一束明光时也没有。

直到分析数据的时候她才意识到视觉刺激其实产生了信号，只不过这个信号非常小。“我非常兴奋，但我的实验室伙伴却有点失望。”她说，“因为这个信号非常小，噪声又很大。”

于是Yang开始尝试调整显微镜设置，增加激光功率，加快成像速度。她说：“我基本上已经调到了显微镜的最大速度。”这是因为电压感受器对电信号的反应非常快，以至于荧光的变化只能在几分之一秒内被检测到。“如果你只在细胞反应期间捕获了一帧画面，那这个反应自然看起来很小。”Yang说。

Yang最终成功使用GEVI研究了果蝇的神经元是如何处理视觉信号的，但迄今为止，她所面临的各种挑战正阻碍电压成像成为一种主流技术。Cohen说，电压成像需要先进的，通常情况下是定制的显微镜。“传统荧光显微镜做不到这一点。”

斯坦福大学蛋白质工程师Michael Lin表示，在过去的五年里，BRAIN计划所提供的资助推动了电压成像领域的进步，包括开发出了更好的GEVI。

在开发新传感器的同时，科学家也致力于探索能够精确捕捉大脑内快速传输的电信号的技术。目前存在的一大挑战是，大多数现有技术仅适用于培养皿中或大脑表面的细胞。但问题是哺乳动物的大脑并不是透明的：事实上，它看起来像豆腐一样，加州大学伯克利分校的物理学家Na Ji说。

为了能够观察大脑深部的神经元，研究人员只能使用一些更具侵入性的方法，比如去除一些覆盖组织或将一种被称为微内窥镜的微小光学设备直接放置到大脑中。

另一种无创且能观察深达1 mm的不透明组织的技术是双光子显微镜。该技术使用的光波长更长，能量更低，能更深地穿透到组织中。双光子显微镜一次仅从一个点进行照射和记录，因此它们捕获图像的速度非常慢，无法跟踪大脑内极为快速的信号传递。但专家们相信，技术的进步将很快能够让双光子显微镜提速以捕捉GEVI发出的信号。“这绝对是可行的。”Ji说。

如果能够克服这些挑战，科学家们毫不怀疑电压成像将成为观察大脑活动的标准方法。斯坦福大学的神经生物学家Thomas Clandinin说：“在接下来的一两年里，我们会看到许多应用电压传感器进行生物学研究的论文。”有人甚至认为电压成像技术或将取代电极成为科研人员探索神经元如何处理和整合信息的常规方法。

年轻的科研人员对电压成像的前景尤为乐观：哈佛医学院的博士后研究员Hochbaum表示，从长远来看，GEVI将成为研究细胞不同部分如何对亚阈值信号做出反应的专业方法。他计划使用电压成像探究这些亚阈值信号如何改变神经元之间的连接，这恰恰是学习的核心过程。

Hochbaum说，这些可能性令人兴奋，但是他从早年全实验室一旦发现荧光就欢呼庆祝的经历中学到了一个重要的教训：即使实验成功，也要在庆祝的时候保持最大程度的节制。

原文以A new way to capture the brain’s electrical symphony为标题

发布在2018年9月19日《自然》新闻特写上

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Nature|doi:10.1038/d41586-018-06694-6

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