“咚咚”，听那极端微生物“敲响地狱之门”

原文作者：Amber Dance

研究人员发明了新方法来研究生活在地球上最不宜居环境中的微生物。

在地球上一些最极端的环境中——从有毒热泉到高海拔沙漠，微生物都在努力活下去。这些“极端微生物”（extremophile）包括能生活在近沸腾的高温或近冰冻的低温、高压或高盐、酸性、碱性、金属或放射性环境下的生物。

诱导这些生物在实验室中生长存在诸多挑战。尽管如此，关于极端微生物的论文数量已经在过去十年里翻了一倍。一些科学家被这些新奇的生物所吸引，想要寻找尚未被描述过或是携带了对工业生产或抗生素救命有用的酶的物种。另一些科学家只是单纯地发现，能够回答他们研究问题的最佳生物体恰好具有这些极端嗜好。

研究人员在土库曼斯坦天然气火山口的土壤样本中寻找微生物，这里也被称为“地狱之门”（Door to Hell）。来源：Stefan Green/XMP

这种情况下，研究极端微生物的研究人员需要发明新的实验方法来处理它们。为了能鉴别、培养、从遗传学上操控并观察极端微生物，研究人员常常需要调整他们在普通微生物身上使用的方法。有些技术很容易就改过来了，比如从一种嗜热生物到另一种高温生物，但有些技术则需要针对不同的生物体进行不同的调整。

“每个极端微生物都自有其挑战，”约翰斯·霍普金斯大学的微生物学家Jocelyne DiRuggiero说道，“每次你想做些什么，你就要思考，我要如何让它来适应我研究的生物体？”

极端生长

2014年，美国佛蒙特大学的微生物学家Scott Tighe联合国际合作者，发起了目前仍在进行的“极端微生物组项目”（XMP, http://extrememicrobiome.org/）。这些研究人员希望能找到可以显示极端微生物如何生存的基因，以及它们是否能产生具有抗生素功效的化合物。

为了寻找新的微生物，科学家深入极端地带，包括埃塞俄比亚达纳吉尔凹地（Danakil Depression）的有毒热泉——含有大量的盐、酸性物质、重金属，以及土库曼斯坦的天然气火山口。

但是，他们最大的挑战还是在实验室里，“可以说是巨大的障碍。”Tighe说。能在极端环境下不灭的都是微生物中的“小强”，这些“小强”是不会被科学家轻易分解再重新恢复它们的DNA的。为此，Tighe和XMP团队开发了一种含六种酶的“鸡尾酒”——已取名“MetaPolyzyme”并上市——来分解它们能发现的所有细胞表面，通过加入清洁剂和有机溶剂，把核酸收集到磁珠上[1]。“我们必须用非比寻常的DNA提取技术才行。”Tighe说。有了技术加持，研究人员便有了一冰箱可以分析的样本，Tighe说。

英国一个研究团队建造了这个加热显微镜系统，用来拍摄嗜热微生物硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的活细胞图像。来源：A. A. Pulschen et al./Curr. Biol. (CC BY 4.0)

在实验室研究活的极端微生物也存在挑战，比如DiRuggiero团队研究的这种从智利高海拔阿塔卡马沙漠的岩石上切下的嗜盐微生物。她说，这些生物中有的很好培养：只要加盐就行了。DiRuggiero还研究过需要在高温无氧环境下生长的厌氧超嗜热微生物。为了培养它们，她将NASA研制的耐高温培养瓶放在95 °C的恒温箱中，这个培养箱太适合烧烤了，团队开玩笑地称它是“披萨烤箱”。塑料皮氏培养皿中的标准琼脂会融化，因此，研究人员选择在玻璃培养皿中放满名为“Gelrite”的结冷胶衍生物，它能抵抗高温。

操纵基因 

改变极端微生物的基因还要做更多工作。对实验室常用的大肠杆菌等微生物可行的工具和技术，包括用来转移遗传物质的质粒、将这些遗传物质插入新微生物的技术，以及能选择成功整合了新基因的微生物的化合物，往往不适合用于高盐、超高温和其他极端环境。

科学家经常用大肠杆菌生成他们想要的基因，分离相关质粒，再把它们转到极端微生物中。一些极端微生物会吸收周围介质里的核酸，科罗拉多大学博尔德分校和美国国家可再生能源实验室的合成生物学家Carrie Eckert说。如果这行不通，她推荐使用电穿孔，也就是用电脉冲在细胞膜上钻孔。

另一个方法，她说，是通过测序确定极端微生物基因组的甲基化模式[2]。这很重要，因为微生物常常会摧毁带有“错误”模式的核酸，来防止入侵者。科学家正在学习如何改变大肠杆菌的甲基化系统，让新的DNA与宿主的相匹配[3]。

一旦能提供正确甲基化的DNA，科学家就必须挑出吸收了这些DNA的极端微生物。为了研究感兴趣的基因，微生物学家常常会把这些基因插入含有抗生素耐药性基因的质粒中；在含有这种抗生素的介质中生长的群落已经吸收了这些基因。但许多抗生素无法在极端条件下发挥作用。另一种选择工具是某个生物在没有特定营养素下生长（或不生长）的能力——这种方法对极端环境不那么敏感。

研究人员还为极端微生物调整了基因编辑技术。Eckert的团队开发了一种编辑嗜热的热纤梭菌（Clostridium thermocellum）基因组的两步法[4]。他们借用另一种嗜热生物的基因交换系统，用来将他们想要的序列导入热纤梭菌中。与此同时，他们 还改变了通常会被CRISPR–Cas系统识别并切割DNA的附近位点，让它们对CRISPR不可见。之后，他们再利用CRISPR–Cas 切割任何没有修饰的基因，清除未编辑的微生物。

这种方法的有效性最高可达94%，对其他极端微生物应该也同样适用，Eckert说。需要的菌株可以从新英格兰生物实验室（New England Biolabs） 和美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）获得，Eckert正在努力把质粒也加入Addgene的基因库。

实时拍摄

为了研究极端微生物的细胞生物学，研究人员对显微镜也来了个大改造。

英国医学研究委员会分子生物学实验室的细胞生物学家Buzz Baum对嗜热嗜酸的硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）的细胞分裂很感兴趣。但Baum说，活的培养物在显微镜载物台上，就和一杯茶凉得一样快，这些细菌接着就进入了假死状态。“我们做了好几年都没有成功。”

该团队决定借用聚合酶链反应机器的一项技术，从顶部和底部同时给培养物加温。他们聘请了实验室一名成员的父亲和兄弟，两人都是航空工程师，他们用飞机用铝打造了一个系统。研究人员已经发表了这个“Sulfoscope”显微镜的示意图[5]，但Baum说任何双重加热系统都可以。这个系统让团队可以研究维持对称细胞分裂的蛋白（见“嗜热细胞分裂”）。

来源：参考文献[5]。

嗜盐微生物也很难在显微镜下研究。它们缺少细菌那种坚硬的细胞壁，而且它们通过维持与周围环境相同的渗透压来生存，这让它们的硬度就像泄了气的气球。也就是说，如果被夹在显微镜载片和盖玻片之间，它们很容易就变形了，因此很难研究细胞的大小和形态。

Ye-Jin Eun在哈佛大学做博士后时便遇到了这个问题，当时她研究的是极端嗜盐古菌（Halobacterium salinarum）是如何控制其大小的。这种生物在液体培养物中呈杆状，但是，当她用软琼脂垫固定细胞做显微镜检查时，它们就会变形成奇怪的多边形或是一团无定形物质。“我们没想到它那么不经压。”Eun说。Eun现在是新泽西州杨森制药的首席数据科学家。马萨诸塞州Millipore Sigma公司的CellASIC ONIX微流控设备能用软聚二甲基硅氧烷固定微生物，但这种物质被证明对Eun的细胞有毒。

最后，她成功通过建造微型的琼脂糖系统小心固定住了这些细胞，发现这个古菌维持大小的方式和细菌差不多，每个新生细胞在分裂前都会在杆体上添加一段固定不变的长度[6]。

荧光发光

显微镜学家还要找到能在极端条件下标记目标蛋白的方法。

一支国际团队在研究死海中发现的沃式嗜盐菌（Haloferax volcanii）时遇到了麻烦，因为它所产生的一种色素会自然发出荧光。这让研究人员很难用荧光蛋白标记来追踪单个分子（团队在7月发布了预印本文章[7]）。为此，团队先删除了参与合成该色素的基因，去掉微生物的颜色，但让其他一切保持不变。

接着，研究人员处理了这种菌的遗传学环境。和许多嗜盐微生物一样，沃式嗜盐菌的DNA含有相对较多的鸟嘌呤和胞嘧啶，所以它的密码子（编码氨基酸的三联体序列）也会使用这些碱基。不仅如此，利用相同密码子的基因的表达水平也会更高。因此，团队优化了在非极端微生物中作用的荧光蛋白的密码子，来配合这些极端微生物的偏好。

“大部分都管用。”文章的作者之一、悉尼科技大学分子微生物学家Iain Duggin说。深红色蛋白mCherry和绿色变红色的光转换标记Dendra2的版本对于单分子追踪格外有用。“这些在细胞分裂和形态还有细胞骨架研究中的应用真的让我们非常激动。”Duggin说。

确实，通过不懈努力，研究极端微生物的科学家让看起来不可能的实验变成了可能。“关键是要去尝试。”Duggin说，“‘极端微生物’，如果你喜欢这么叫的话，通常没有你一开始想的那么难。”

参考文献：

1.Tighe, S. et al. J. Biomol. Tech. 28, 31–39 (2017).

2. Flusberg, B. A. et al. Nature Methods. 7, 461–465 (2010).

3. Riley, L. A. et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 46, 1435–1443 (2019).

4. Walker, J. E. et al. Metab. Eng. Commun. 10, e00116 (2020).

5. Pulschen, A. A. et al. Curr. Biol. 30, 2852–2859 (2020).

6. Eun, Y.-J. et al. Nature Microbiol. 3, 148–154 (2018).

7. Turkowyd, B. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.27.222935 (2020).

原文以Studying life at the extremes为标题发表在 2020年10月27日的《自然》的科技特写版块上

© nature

doi: 10.1038/d41586-020-03055-0

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