ISME/普通菜豆抗性育种对根际微生物组结构与功能的影响

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题目：Influence of resistance breeding in common bean on rhizosphere microbiome composition and function

普通菜豆抗性育种对根际微生物组结构与功能的影响

期刊：ISME（2017）

IF：9.4

通讯作者: Lucas William Mendes

摘要：

        根际微生物群在植物生长和健康中起着关键作用，为防止土壤病原菌感染根提供了第一道防线。本文研究了不同抗真菌根病原镰刀菌（Fusarium oxysporum，Fox）的普通菜豆（Phaseolus vulgaris）品种根际细菌群落的组成和代谢潜力。不同菜豆品种在两种土壤中的理化性质和微生物多样性差异较大，根际细菌丰度与抗FOX呈正相关。抗FOX品种根际假单胞菌科、芽孢杆菌科、独角菌科和噬纤维菌科较丰富。网络分析表明，抗FOX品种根际微生物群落呈模块化拓扑结构，表明该品种根际细菌群落比易感品种根际细菌群落更复杂、联系更紧密。宏基因组分析进一步表明，抗真菌药物吩嗪和鼠李糖脂的蛋白质分泌系统和生物合成基因等功能特性在抗FOX品种根际细菌群落中更为丰富。我们的研究结果表明，普通大豆抗FOX育种可能与其他未知植物性状共同选择，这些性状支持根际更丰富的特定有益细菌家族，其功能特性加强了第一道防线。

背景与意义

        根际微生物组在营养获取，抗逆胁迫，抗病原入侵等方面有很大作用。植物种类、品种和土壤类型是根际微生物组成和功能的关键驱动因素。利用植物遗传特性可提高植物生长和对生物和非生物胁迫的耐受性。尽管人们越来越了解根际微生物群对植物的有益作用，但很少有育种计划考虑到根际相关性状。另外，抗病性是否也影响其他作物根际微生物群的组装，以及根际微生物群的功能潜力还不清楚。本文研究了普通菜豆（Phaseolus vulgaris）对根际病原菌Fox的抗性育种如何影响根际微生物群的组成以及根际微生物群提供的与第一道防线相关的特定功能性状的丰度。

实验设计：

两种土壤：ADE土壤特点是高肥力和高微生物多样性。AGR土壤的特征是氧化土（具有非常低的养分储量和极低的自然肥力，低的有效持水量），该地区已用于普通大豆和玉米的农业试验。

四个品种（根据对FOX病原的不同抗性选择）菜豆温室条件下在以上两种土壤（种植前为初始土）种植至初花期收集根际土

初始土与根际土（提取DNA，定量PCR，16srRNA测序分析，鸟枪法宏基因组测序）

实验主要结果与讨论

1.土壤性质与微生物招募的“根际效应”

（Rhizosphere effect根际效应：指植物根系的细胞组织脱落物和根系分泌物为根际微生物提供了丰富的营养和能量，使植物根际中的微生物数量和活性显著高于根外土壤的现象）

图1注：对4个普通菜豆品种的两种土壤和根际的分类（a）（16s rRNA）和功能（b）（宏基因组）情况和环境特征进行了冗余分析（RDA）。箭头表示环境参数和微生物结构之间的关系。所示的环境参数是根据通过Monte Carlo置换检验（P<0.05）评估的显著相关性来选择的；Rhizo=根际土壤；Rs=抗性；Sc=易感；Mg=镁；Ntotal=总氮；OM=有机质；P=磷。

  试验中使用的两种土壤类型，ADE和AGR，在理化性质上有显著差异。分子分析证实了这一对比，发现ADE的DNA回收量和细菌丰度高于AGR土壤。在ADE和AGR两种土壤中，4个豆品种的栽培均对根际土壤理化性质有显著影响，其中K和H+Al含量较土壤显著下降（P<0.05）。然而，豆栽培增加了钙、铁含量基础饱和指数（P<0.05）。总的来说，AGR土壤的根际效应更强。这些变化很可能是由于植物发育过程中发生在根-土界面的几个过程，包括分泌物的释放、水和养分的吸收以及根呼吸。此外，根际养分有效性还受土壤性质、植物特性和微生物活性之间的相互作用控制。除了这些化学变化外，所有豆品种根际细菌群落的分类组成和功能情况都不同于土壤，这是众所周知的根际效应的例证。普通豆品种间的分类学差异在ADE土壤中表现得更为明显，不同品种间根际群落结构差异显著。在功能情况上（图1b），土壤类型解释了77.9%的情况，样本类型在RDA的第二轴聚集。然而，基于这四个不同的品种不能区分功能图谱。正向选择和Monte Carlo置换检验表明，根际细菌群落结构与磷含量、有机质、铜和总氮等理化性质相关（图1），这些参数在ADE和AGR之间有明显的不同。

图2注：亚马逊河黑土和农业土壤中4个常见豆品种土壤和根际微生物16srRNA序列的门级分类。

       将各品种根际的OTUs与初始土壤的OTUs进行比较，发现平均8.6%和9.4%的OTUs只存在于ADE和AGR种植的大豆根际。核心根际微生物群，即四个品种之间共享的细菌OTUs，占所有OTUs的约73%。当我们将核心微生物组的OTUs与初始土壤进行比较时，我们发现在土壤中未检测到的所有品种的根际平均存在8.6%的OTUs。对不同品种根际OTUs进行比较，平均2.5%为品种特异性。这种品种特异性在AGR土壤中表现得更为突出，抗FOX品种具有4.5%的独特OTUs。抗FOX品种根际细菌（otu）隶属于13个门，以放线菌（21.2%）、拟杆菌（15.8%）、疣状芽胞菌（15.5%）和变形菌（11.9%）为主，在ADE和AGR土壤中有一定的差异。

图3注：Venn图显示了四个普通大豆品种的根际微生物群和亚马逊黑土（A）和农业土壤（B）的核心根际和土壤之间唯一和共享的OTU的数量和比例（97%相似）。

图4注：在亚马逊黑土（ADE）和农业土壤（AGR）抗性品种根际微生物群中唯一检测到的OTUs的分类。

图5注：土壤和根际微生物类群差异有统计学意义（韦尔奇双边检验，P<0.05）。

       我们对根际样品进行了分类，并与土壤中的门丰度进行了比较。考虑到这两种土壤类型，根际有5个门更为丰富，分别是装甲菌门、衣原体门、蓝藻门、糖化假丝酵母和栖热菌门（图5）。这些群体中的一些成员在营养循环中扮演着重要的角色。在之前的一项研究中，我们表明大豆植物能够根据与植物利益相关的功能核心（如促进生长和营养）招募微生物类群。通过分析功能图谱，我们在根际发现了大量与运动性和趋化性相关的序列。鞭毛运动以及群体感应，使微生物种群能够主动获取可用资源，避免捕食者捕食。我们还发现了大量与膜转运相关的序列。一些膜转运系统有助于提高微生物群落的竞争力，例如VI型分泌系统（T6SS），其功能是介导毒力因子的胞外输出及其向目标真核细胞的转运。其中的一些功能也可能阻碍病原菌入侵，有助于根际微生物群作为第一道防线的功能。有趣的是，当我们对每一个品种的这两种功能进行分析时，我们发现在ADE土壤中，抗FOX品种的膜转运基因的丰度比易感FOX品种的高，在AGR土壤中，抗FOX品种的运动和趋化基因的丰度也比易感FOX品种的高。

图6注：（A） 土壤与根际功能类型（种子子系统1级）差异有统计学意义（韦尔奇双边检验，P<0.05）。基于鸟枪基因组学数据的隶属关系。校正后的P值使用Benjamini-Hochberg错误发现率方法计算。（B） 四个菜豆品种和土壤功能分类序列的差异丰度。

2.抗FOX豆品种对根际微生物的调控

       为了探讨植物对病原菌的抗性与根际微生物组成的关系，我们选择了最具抗性（IAC-Milenio）和最易感（IAC-Alvorada）的大豆品种进行了详细的分析。我们试验中使用的抗病品种IAC Milenio来自两个品种之间的杂交，另一个是易感品种IAC Alvorada的兄弟系。虽然它们是遗传相关的，但我们假设即使抗FOX品种基因组的微小变化也可能影响根际群落的组装。在抗FOX大豆品种中，真菌在相邻木质部导管之间的定殖受到化学和结构变化的限制。在最近的一项研究中，Beckers等人证明木质素生物合成的变化调节了植物内生微生物群的组成。考虑到植物的生长、发育和健康相关的功能和特性至少部分依赖于根际微生物组，我们推测，普通大豆抗性育种可能无意中共同选择了影响有益品种特定微生物群招募的植物性状。

图7注：基于16s rRNA的亚马逊黑土和农业土壤根际微生物群落多样性测定。（a） 基于观察到的otu数目丰富度；（b）系统发育多样性基于97%相似性计算为Faith  PD；（c）基于Shannon指数多样性；（d）细菌16S rRNA基因的丰富度。误差条表示四个独立复制的标准偏差。不同小写字母表示基于T-检验的处理之间的显著差异（P<0.05）

       根据丰富度和所使用的多样性指数，即香农和Faith PD，抗性品种与初始土壤相比呈现出更高的细菌群落多样性（图7a-c）。有趣的是，在ADE土壤中生长的抗FOX品种根际细菌丰度较高（图7d），随着对病原菌的敏感性增加，大豆品种根际细菌丰度降低。对于多样性，我们可以观察到两种土壤类型的相似趋势，但是，在统计学上并不显著。抗性品种根际细菌丰度越高，资源竞争越激烈有助于防止真菌感染。资源竞争在高度丰富和多样化的群落中得到加强，并被认为是病原体入侵成败的关键因素。（前面的学习也提到，抵抗病原入侵主要通过代谢产物的直接抑制与资源竞争，这里发现在高丰富度与多样性的根际土壤中资源竞争被加强从而抵御病原菌入侵SBB/土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组,Ecology Letters /方便植物相关微生物群落入侵）

图8注：采用主成分分析法（PCA）对两种土壤类型和两个普通豆品种根际的分类（16srrna数据集的OTU水平）进行了分析，比较了对病菌的抗性水平。通过单向PERMANOVA检验评估P值。Rs=抗性品种Milenio的根际；Sc=敏感品种Alvorada的根际；土壤=初始土壤群落；ADE=亚马逊黑土；AGR=农业土壤。

图9注：最具差异的科，属水平菌群分布在不同品种与不同土壤。

     抗性和感病大豆品种根际微生物群的比较分析表明，它们具有明显的群落结构和不同的科水平丰度（图8和图9）。这些结果扩展了Yao和Wu（2010）的研究结果，他们证明了黄瓜抗尖孢镰刀菌品种的根际群落结构与感病品种不同。我们对这两种土壤类型的16srrna和宏基因组序列数据进一步表明，在抗性品种的根际中，假单胞菌科、芽孢杆菌科、噬纤维菌科和独角菌科植物的丰度较高。在较低的分类水平上，我们发现ADE抗性品种根际假单胞菌属和芽孢杆菌属有很高的丰度。这两个细菌属以生物施肥、促进根系生长、根修复、抑制非生物胁迫和植物病害而闻名。在一项关于普通豆的研究中表明，假单胞菌对镰刀菌根腐病具有生物防治作用。

图10注：在两种不同土壤中生长的抗性和易感普通大豆品种根际微生物组中细菌功能相关序列的差异丰度（基于宏基因组数据集）。这些序列属于基于SEED数据库（a和b）3级和（c）2级的功能。抗性=抗性品种Milenio的根际；敏感=敏感品种Alvorada的根际；ADE=亚马逊黑土；AGR=农业土壤。

    根据宏基因组数据，假单胞菌和芽孢杆菌的序列与营养相关代谢和一些拮抗特性有关，如吩嗪和几丁质酶的生物合成、应激反应、次级代谢、运动、趋化、休眠和产孢。对宏基因组数据的进一步研究表明，在ADE土壤中生长的抗性品种IAC Milenio的根际中，与吩嗪和鼠李糖苷生物合成相关的序列更为丰富。吩嗪类抗生素在抑制不同作物上的尖孢镰刀菌方面具有关键作用。此外，有报告说，假单胞菌产生的吩嗪抗生素有助于自然土壤抑制枯萎病。鼠李糖脂，也由假单胞菌产生具有抗菌特性，并对包括镰刀菌在内的几种真菌起作用。在抗性品种的根际细菌群落中，我们还发现了更多与ABC转运体和蛋白质分泌系统相关的序列（图10c）。其中一些功能与各种毒力因子（如抗生素、细菌素、毒素）的输出有关，这些毒力因子可能增加群落内阻碍病原体入侵的竞争。因此，根据我们的发现，我们假设抗性品种能够更好地招募有益的微生物群，除了植物的遗传特性外，这些微生物群还可以补充对病原体感染的防御。

3.根际微生物组的网络结构

图11注：根际微生物群落与土壤样品的共发网络生分析。关联表示SparCC关联度>0.7（正相关-蓝边）或<0.7（负相关-红边），具有统计显著性

（P<0.01）。每个节点代表属级的附属分类群（基于16srRNA），节点的大小与连接数（度）成正比。每个节点都在门级标记。

表1：普通大豆根际微生物网络的相关性和拓扑性质

a微生物分类群（属级），至少有一个显著的(P<0.01) 连接（>0.7）

b通过SparCC分析获得的连接数/相关性

cSparCC正相关(>0.7 ,P<0.01)

d SparCC负相关(>0.7 ,P<0.01)

e节点形成高度连接群落的能力，即节点间连接密度高的结构（由Gephi推断）。

f群落被定义为一组内部紧密连接的节点（Gephi）。

g网络中节点之间的最长距离，以边数（Gephi）度量

h所有节点对之间的平均网络距离或网络中所有边缘的平均长度（Gephi）

i络中每个节点的平均连接数，即节点连接（Gephi）

j节点如何嵌入到它们的邻域中以及它们倾向于聚集在一起的程度（Gephi）。

       我们利用共生网络分析探讨了不同普通豆品种根际微生物群内部连接的复杂性。为此，我们基于16s rRNA数据计算了属级微生物类群之间的SparCC相关性。然后，我们计算得到的网络的拓扑性质，以识别样本之间的差异。抗性品种表现出最高水平的复杂性和模块化结构，而易感品种表现出较低的复杂性（图11）和较低的模块化网络（表1）。据推测，高度多样化的细菌群落通常对病原体入侵更具抵抗力。这一假设基于多样性群落表现出更高数量的物种相互作用和对生态位空间的激烈竞争的假设。虽然抗性豆品种与易感大豆品种根际细菌多样性差异不显著，但抗性豆品种的根际细菌网络复杂度较高。Wei等人提出多样性入侵抗性之间的关系可以通过潜在的交互网络结构进行解释。与其他品种相比，抗性品种的网络节点连接数最高（平均度=84.59），平均路径长度（1.66）和直径（6）较低，表明群落高度相连（表1）。平均路径长度定义为每个节点之间沿最短路径的平均步数，是网络效率的一种度量。

       抗性品种的网络呈现出一种更模块化的结构（表1），其特征是存在内部具有大量互连的不同节点组，并且组之间具有某种程度的独立性。模块化结构表明物种角色和功能的多样性，增加了生态位重叠。从这个意义上讲，高度连接和模块化的根际微生物群如果能导致更有效的资源消耗，则可以降低病原体入侵的成功率。此外，模块化结合较短的平均路径长度可能意味着微生物群落对环境扰动的反应更迅速。

       基于网络特性，我们确定了三个中间性中心度更高的菌群，即一个节点作为另两个节点之间最短路径桥梁的次数。在网络分析中，中心性表明了最重要的节点，这可能被解释为连通群落中的关键类群。最具中心性的前三个节点是（1）拟杆菌门（Dyadobacter）属，（2）Comamonadaceae科（变形菌门）成员，（3）一个隶属于酸杆菌Gp16的分类单元。有趣的是，Dyadobacter属被认为是参与香蕉根际枯萎病抑制的潜在分类群，而Comamonadaceae科被鉴定为与棉花植物相关的FOX抑制细菌分类群。另外，这三个关键的细菌群在抗性品种的网络中是相互联系的。关键类群代表与许多其他类群相关联的节点，移除该节点可能会对群落结构产生重大影响。重要的是要注意，病原体侵略者可能会设法取代关键类群并破坏网络结构 。

结论

       根际微生物群在植物生态系统功能中的重要性已被广泛认识，但传统的植物育种方法没有考虑到植物微生物群。本文对不同抗性程度的普通豆品种根际微生物进行了深入分析。尽管FOX抗药性是基于植物的遗传特性，但我们的数据支持这样一种假设，即抗性育种可能无意中改变了根际微生物群的组成，改变了有益微生物的频率和可能有助于植物生长或有助于抵御病原体的特性。考虑到FOX的抗性是基于植物的遗传和化学变化，我们的研究结果表明，根际微生物群落的变化可以加强第一道防线，通过特定微生物类群和功能的更丰富、微生物多样性、丰富而复杂的网络结构的提高来限制病原菌的入侵。我们还发现，根际微生物群落的招募高度依赖于土壤类型，亚马逊黑土土壤为潜在有益微生物提供了更丰富的来源。

总结

       本文对不同抗性程度的普通豆品种根际微生物进行了深入分析，证实了抗性育种可能无意中改变了根际微生物群的组成，改变了有益微生物的频率和可能有助于植物生长或有助于抵御病原体的特性。现阶段有很多证据说明网络结构越复杂，群落多样性越高，在抵御病原入侵与逆境胁迫的能力更强，前面学习内容也有很多证据支持支持观点(Geoderma/豆科植物根际细菌群落的复杂性促使菲的降解，Science Advances/最初的土壤微生物群落组成和功能决定了未来植物的健康状况,SBB/土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组)但是多样性问题仍然需要更多的证据去支持而不是用群落多样性去回答一些问题。另外，种子本身的内生菌是否在其中发挥重要作用不得而知，这也是可以研究的一个重点Microbiome/甘蓝型油菜种子微生物群的结构与品种有关，并影响共生体与病原菌的相互作用。

（总结部分仅仅是个人的一些不成熟或者可能不正确的想法，可自行忽略）

微信号 : lida179438448

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