RNA-seq入门实战（一）：上游数据下载、格式转化和质控清洗

连续两次求贤令：曾经我给你带来了十万用户，但现在祝你倒闭，以及 生信技能树知识整理实习生招募，让我走大运结识了几位优秀小伙伴！大家开始根据我的ngs组学视频进行一系列公共数据集分析实战，其中几个小伙伴让我非常惊喜，不需要怎么沟通和指导，就默默的完成了一个实战！

他前面的分享是：

下面是他对我们b站转录组视频课程的详细笔记

本节概览：

• 1.在文章中找到 GEO accession number, 从NCBI获取数据SRR号

• 2.在linux中使用prefetch命令根据SRR号下载SRA文件

• 3.使用fasterq-dump/fastq-dump命令将SRA文件转为FASTQ格式，pigz软件多线程压缩（可选）

• 4.使用fastqc和multiqc进行测序数据的质控查看5.使用trim-galore去除低质量碱基和接头

承接上节RNA-seq入门实战（零）：RNA-seq流程前的准备——Linux与R的环境创建

一、从NCBI获取数据SRR号

数据的文章来源：
Formative pluripotent stem cells show features of epiblast cells poised for gastrulation | Cell Research (nature.com)
在文章的Data availability 下找到 GEO accession number: GSE154290

进入NCBI官网搜索GSE154290，选择相应结果进入

找到Supplementary file 下的SRA Run Select选项

Common Fields下介绍了数据的基本信息，例如表中的PAIRED表示双端测序数据。此次实战选择勾选 Found 27 Items下的RNA_mESCs和RNA_EpiSCs各两个数据，再选中Select下的Selected选项，下载Accession List后复制数据的SRR号

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二、SRA数据下载

1.创建并进入test项目文件夹，将SRR号粘贴导入idname文件

mkdir test ;cd test 
cat > idname 
SRR12207279 
SRR12207280 
SRR12207283 
SRR12207284 
^C 

2.创建SRA数据下载的脚本文件

vim 00_prefetch.sh  

主要利用了sra-tools中的 prefetch命令下载sra数据

#sh内容################################ 
echo -e "\n \n \n prefetch sra !!! \n \n \n " 
date 
mkdir -p ~/test/raw/sra/ 
cd ~/test/raw/sra/ 
pwd 

cat  ~/test/idname | while read id ; \ 
do       
  ( prefetch -O ./ $id & ) 
done   

3.后台挂起运行脚本，运行情况导入log_00日志文件

nohup bash 00_prefetch.sh >log_00 2>&1 &

查看一下系统任务运行情况和test项目下的文件结构

任务运行没问题，等待数据下载完毕，暂时去relax一下吧ヽ(￣▽￣)ﾉ
当cat log_00出现以下downloaded successfully字样时表示下载完成，再检查数据下载情况，确认下载完成没问题后就可以进行下一步文件格式转化啦

prefetch.log

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三、 SRA文件转为FASTQ格式

主要利用了sra-tool中的fasterq-dump命令转化格式为fastq，之后用pigz软件多线程压缩为.gz文件节省空间（可略过），再用fastqc和multiqc进行原始数据的质控和质控汇总~

fasterq-dump/fastq-dump常用参数

同上，先创建 01_sra2fq_qc1.sh 脚本文件

vim 01_sra2fq_qc1.sh  

########################################### 
#移动sra子文件夹下的文件并删除子文件夹 
date 
echo  -e "\n \n \n  111#  move files !!! \n \n \n  " 
cd ~/test/raw/sra/
cat ~/test/idname | while read id do 
mv $id/*  ./ 
rm -rf $id/ 
done 
date 


echo  -e "\n \n \n  111#  sra>>>fq !!! \n \n \n  "
mkdir -p ~/test/raw/fq/
cd ~/test/raw/fq/
pwd
ls  ~/test/raw/sra/*.sra |while read id 
do
echo " PROCESS $(basename $id) "
fasterq-dump -3 -e 12 -O ./ $id
pigz -p 12   ~/test/raw/fq/*q
done
date


echo -e " \n \n \n  111# qc 1 !!! \n \n \n "       
mkdir ~/test/raw/qc1/
cd  ~/test/raw/qc1/
pwd
ls ~/test/raw/fq/* | xargs fastqc -t 12 -o  ./
multiqc ./

echo -e  " \n 111#  ALL  Work Done!!! \n "
date

运行01_sra2fq_qc1.sh 脚本文件

nohup bash 01_sra2fq_qc1.sh >log_01 2>&1 &

等待任务完成，查看一下raw文件夹下数据

tree raw

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四、质控清洗

1. 原始数据质量查看

查看上一步qc1文件夹下的multiqc_report.html质控汇总网页文件，主要关注测序质量与测序接头这两项内容，可以发现该数据质量较好，平均质量均在30以上，接头含量也很低。
具体内容分析见：
20160410 测序分析——使用 FastQC 做质控 - 知乎 (zhihu.com)

小L生信学习日记-3丨原始数据质量如何判断？-上 (qq.com)

小L生信学习日记-4丨原始数据质量如何判断？-下 - 知乎 (zhihu.com)

2. 质控清洗数据

主要使用trim-galore去除低质量碱基和接头，详尽使用方法参见lncRNA组装流程的软件介绍之trim-galore
常用参数如下：

trim-galore常用参数

vim 2_cleanfq_qc2.sh  

##############################################
echo -e " \n \n \n 222# Clean ! trim_galore !!! \n \n \n"
date
mkdir ~/test/clean/
cd ~/test/clean/
pwd

##########single###########################################################################
#ls ~/test/raw/fq/*.f* | while read id 
#do 
#       trim_galore -q 25 -j 4 --phred33 --length 35 --stringency 3 \
#               --gzip  -o ~/test/clean/  $id 
#done
#
##########paired###########################################################################
#1）先把文件_1、_2的路径文件名分别存储，再合并成两列的格式，存为config#########
  ls ~/test/raw/fq/*_1*  >1
  ls ~/test/raw/fq/*_2*  >2
  paste 1 2 >config
  cat config | while read id
  do
    arr=($id)
    fq1=${arr[0]}
    fq2=${arr[1]}
   trim_galore  -j 4  -q 25  --phred33 --length 35 --stringency 3 \
               --paired --gzip -o ~/test/clean/  $fq1 $fq2
  done
###########################################################################################                  


echo -e "\n \n \n 222# qc2 检查clean清洗结果!!! \n \n \n"
mkdir  ~/test/clean/qc2
cd ~/test/clean/qc2
pwd
ls ~/test/clean/*f*.gz | xargs fastqc -t 12 -o   ~/test/clean/qc2
multiqc   ./

echo -e " \n 222# ALL  Work Done !!! \n "
date

nohup bash  2_cleanfq_qc2.sh >log_2 2>&1 &

3. 清洗后数据质量查看

查看~/test/clean/qc2下的multiqc_report.html质控汇总网页文件，碱基质量更好一些了

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到此，我们完成了RNAseq原始数据的下载、格式转化和质控清洗步骤，得到了经过质控后存放于clean文件夹下的fastq文件，接下来就可以利用这些cleaned fastq文件进行下一步的比对、计数（hisat2+feature_counts 或 salmon），最终得到我们想要的counts文件

参考资料

20160410 测序分析——使用 FastQC 做质控 - 知乎 (zhihu.com)

小L生信学习日记-3丨原始数据质量如何判断？-上 (qq.com)

小L生信学习日记-4丨原始数据质量如何判断？-下 - 知乎 (zhihu.com)

lncRNA组装流程的软件介绍之trim-galore

本实战教程基于以下生信技能树分享的视频：

【生信技能树】转录组测序数据分析_哔哩哔哩_bilibili

【生信技能树】GEO数据库挖掘_哔哩哔哩_bilibili

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